伪狂犬病病毒鄂A株TK－／gG－／LacZ＋突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK     

伪狂犬病病毒鄂A株TK－／gG－／LacZ＋突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1-4,进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^ 突变株基因组DNA共转染PK－15细胞,等完全病变后,收毒作空斑试验,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的无TK^-/LacZ^ 突变株污染的TK缺失的重组病毒,分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增,扩增产物经酶切分析和测序后发现：TK缺失重组病毒的TK基因缺失了205个碱基,XhoⅠ和SalⅠ位点消失,SmaⅠ酶切片段发生变化,两种病毒在PK－15细胞上形成空斑的大小和增殖 滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,与含gG-LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK－15细胞,待完全病变后,在X-gal存在下筛选蓝斑,将桃取的蓝斑纯化3次后,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段,同时又能扩增出LacZ基因,证实所得到的重组病毒为TK^-/gG^-/LacZ^ 突变株。此双缺失突变株的构建成功,为在我国最终根除伪狂犬病提供了有用的工具。     

伪狂犬病病毒gC基因在IBRS-2细胞中的表达及其对病毒繁殖的影响

 对含伪狂犬病病毒 Ea株 g C全基因的质粒 p UC1 .75进行亚克隆 ,将其完整编码区置于真核表达载体 pc DNA3.1 +的 HCMV启动子 /增强子下游 ,构建了 g C基因真核表达质粒 pc DNA-g C.脂质体转染 IBRS- 2细胞 ,在 G41 8抗性选择下 ,获得多个阳性克隆细胞系 .经 ELISA筛选反应最强的阳性克隆细胞系 ,进一步用间接免疫荧光检测证实 g C基因在 IBRS- 2细胞中得到了正确表达并分布在细胞膜 .以 1 0 0个蚀斑形成单位的伪狂犬病病毒分别接种表达 g C的细胞系和空白载体转染细胞系 .通过测定蚀斑数发现 ,表达 g C的细胞系对病毒的感染具有抑制作用 ,平均抑制率达 59.4%± 1 .3% .     

特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选

EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关.为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRV Ea株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12,分别克隆到以CMV启动子的siRNA表达载体pSilencer 4.1-CMV neo中,构建相应的重组表达质粒p4.1-EP04、p4.1-EP08和p4.1-EP12.同时,将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中,按照读码框架与EGFP基因的5'端融合,获得重组表达质粒pEP0-EGFP.将p4.1-EP04、p4.1-EP08、p4.1-EP12和阴性对照质粒p4.1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞,荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明,三个siRNA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达,抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04;在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论.这为深入研究EP0基因在PRV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入和释放依赖细胞膜胆固醇

胆固醇是细胞膜脂质的重要组成成分.目前的研究发现细胞膜胆固醇在病毒的感染中扮演十分重要的作用.本研究对细胞膜胆固醇在猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染MARC-145细胞中的作用进行了探讨.通过TCID50检测和Real-Time RT-PCR分析发现,用胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精预处理消除细胞膜胆固醇可显著抑制PRRSV的感染,并呈剂量依赖性;而补充外源性胆固醇后可部分恢复PRRSV的感染性,提示PRRSV感染能力的下降确实是由于细胞膜胆固醇的去除而导致的.进一步的研究证实,细胞膜胆固醇的去除对PRRSV感染性的影响主要是通过影响PRRSV的侵入和释放过程.上述结果表明,细胞膜胆固醇是影响PRRSV感染的一个重要因子.     

猪δ冠状病毒的研究进展

δ冠状病毒(Deltacoronavirus)是冠状病毒科冠状病毒亚科的新成员,可感染鸟类和哺乳动物。δ冠状病毒最早于2007年从亚洲豹猫和中国白鼬獾群中检测到。2014年,猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)在美国流行并成功分离到病毒,人工感染实验证实PDCoV可导致仔猪腹泻,具有较强的致病性,成为研究δ冠状病毒的良好模型。本文对PDCoV的发现、病原学、流行病学、致病性、培养与检测等方面进行综述。     

伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3.76 kb的基因组片段,该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列.UL31、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.5%~73.4%,偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率最高,占氨基酸残基总数的36.4%.PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98%以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95.7%和94.8%.UL31基因在疱疹病毒α-亚科所有成员之间都很保守,并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高.UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高.UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究

根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHI位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK-VP2.采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ 株的基因组DNA与pUSK-VP2共转染PK-15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPV VP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP 2株,Southern blotting、SDS-PAGE、Western blotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验.结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ 亲本株的基因组中,并获得了表达.表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒.同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.