毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达

【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。     

麻黄碱通过调控TGF-β1/NF-κB信号通路抑制小鼠的气道炎症反应

为了研究麻黄碱通过调控转化生长因子β1/核因子κB (transforming growth factor-β1/nuclear factor-κB,TGF-β1/NF-κB)信号通路对哮喘小鼠气道炎症和气道重塑的影响,将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、哮喘模型组、麻黄碱低剂量组、麻黄碱高剂量组和地塞米松组,并利用卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)联合氢氧化铝腹腔注射法构建小鼠哮喘模型。药物处理14 d后,通过无创性肺功能检测法测量小鼠气道反应性,采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE staining)观察小鼠肺组织病理情况,采用瑞氏-吉姆萨染色法分析小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的炎症细胞比例,利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠血清OVA特异性免疫球蛋白E (immunoglobulin E, Ig E)的表达水平及BALF中炎症因子的表达水平,利用免疫印迹法检测小鼠肺组织TGF-β1...     

人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达及协同作用研究

利用双启动子构建含人补体调节蛋白DAF和MCP cDNA的双顺反子重组表达载体pcDNA3-DAFMCP-DP, 以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞, 用G418筛选获得NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP转化细胞。PCR实验结果显示人补体调节蛋白基因DAF和MCP整合在转化的异源细胞的染色体上。RT-PCR和Western blot印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子DAF和MCP在细胞系中皆获得同步表达。检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP结果表明人DAF和MCP基因仍稳定整合在细胞基因组中, 并未随着传代而丢失, 为稳定的转双基因细胞系。补体依赖的细胞毒反应表明, pcDNA3-DAFMCP-DP转染细胞系由于DAF和MCP的共表达获得较DAF或MCP单一表达时更强的保护能力, 能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生, 保护宿主细胞免受人补体的攻击。以上结果表明, DAF和MCP双基因重组表达载体实现了人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达, 为获得表达多种人补体调节蛋白的理想供体提供了有效策略。而且共表达的DAF和MCP具有协同效应, 能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤, 在克服超急性排斥反应的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。     

同源过表达fnr、pncB和fdhF对克雷伯菌产氢代谢的影响

利用代谢工程手段改造克雷伯菌Klebsiella sp.HQ-3产氢途径中相关代谢调控因子及辅酶因子,以构建高效产氢工程菌。利用简并引物,以Klebsiella sp.总DNA为模板,克隆了甲酸-氢裂解酶系统的全局转录调控因子(FNR)fnr基因、编码甲酸脱氢酶(FDH-H)fdhF基因,以及NADH途径中编码烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)的pncB基因,构建了3种同源过表达重组菌株HQ-3-fnr、HQ-3-fdhF和HQ-3-pncB,以研究同源过表达产氢代谢调控因子及辅酶因子对克雷伯菌累积产氢、细胞生长、代谢终产物的影响。结果表明,过表达fnr、pncB和fdhF基因的克雷伯工程菌的产氢效率比携带空载体的克雷伯对照菌株分别提高12.26%、11.62%和7.28%;重组菌HQ-3-fnr、HQ-3-fdhF和HQ-3-pncB的葡萄糖利用率较克雷伯对照菌株HQ-3-C明显增加,过表达fnr、fdhF基因使代谢合成甲酸量增多;过表达pncB基因能促进NADH合成,使更多的NADH流入消耗NADH较多的乙醇与琥珀酸代谢路径,使得乙醇和琥珀酸含量增加,而乳酸含量降低。     

植物种群分子进化中对生境的适应——对荒漠植物遗传多样性研究结果的初步分析

长期以来,自然选择理论与中性理论对生物分子进化中的环境适应机理存在着激烈争论。目前,在植物种群分子进化中对生境适应的研究中正面临着一些难题：中性突变是分子水平进化的唯一原因,自然选择发挥主要作用的适应性进化是否存在于分子水平,选择与中性两种学说两种机制完全不同,如何才能将两者联系和统一起来,部分学者利用建立各种模型来描述自然选择对分子标记位点以及连锁序列的直接作用,如生态位宽度变异假设等。本研究小组以新疆阜康荒漠植物为研究对象,通过对两种重要荒漠植物遗传多样性的研究,分析两种植物各亚种群不同生境的生态因子与其遗传变异的关系,讨论生态位宽度变异假设,揭示遗传变异的产生与维持。中性论者与选择论者都试图解释生物环境适应与分子变异之间的关系。中性论和选择论是反映进化的两个侧面,它们不是绝对的,可以相互转化。     

高雄山虫草无性型细脚拟青霉的核型分析

对高雄山虫草无性型细脚拟青霉的酶解条件、原生质体制备、电泳条件和核型进行了研究。以10mg/mL相同浓度的溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶配成混合酶解液,在30℃、120r/min振荡处理18h菌龄的菌丝2.5h,获得约107个/mL的原生质体悬浮液。浓缩至约108个/mL原生质体悬浮液与1.4%的低熔点琼脂糖等体积混合制胶,50℃蛋白酶K酶解48h,ET液洗3次(每次1h),浸没,4℃保存。以温汉逊氏酵母Hansenula wingei YB-4662-VIA和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe 972h-染色体DNA作为标准,利用钳位均匀电场脉冲电泳系统电泳,细脚拟青霉染色体组被分离成8条带,利用AlphaEase Fc软件分析,估计其大小在0.43-5.78Mb之间,大小分别为:0.43、2.45、2.55、2.88、3.28、3.94、4.70、5.78Mb,推测细脚拟青霉核型大小约为26.01Mb。     

新疆阜康荒漠红砂种群构件结构与环境因子的灰色关联度分析

 以构件理论为基础,运用灰色关联度分析技术,对新疆阜康荒漠红砂(Reaumuria soongorica)自然种群构件结构及其与环境因子的关系进行了研究。结果表明：1）植株冠幅是表征红砂生长情况的重要指标,随着红砂植株冠幅的增大,植株高度明显增加,而且植株冠幅与植株的一级分枝