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人血管能抑素基因的克隆、表达及其表达产物的纯化和生物活性测定 总被引:5,自引:0,他引:5
以人胎盘脐带组织为材料,提取组织总RNA,用netRTPCR方法合成人血管能抑素cDNA基因,将该cDNA克隆进pSP72载体获得重组质粒pSP72C, DNA序列分析结果与预期序列一致。用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切,切下pSP72C上的血管能抑素cDNA,插入pET3c载体的相应位点获得重组表达质粒pETC, 转化E. coli BL21(DE3), SDSPAGE分析显示:在IPTG诱导下,血管能抑素基因获得了高效表达,表达量约占菌体总蛋白的 27.9 %,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白复性以及Sephadex G75凝胶过滤层析等步骤后,获得了纯度达91.4 %的人血管能抑素。CAM实验证明10 μg纯化蛋白就能显著抑制鸡胚新生血管生成。 相似文献
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将酵母交配因子 (MF)α1信号肽编码序列和人血管抑制素 (hAGN)cDNA融合序列插入穿梭载体pYADE4 ,构建得到分泌型重组表达质粒pYADEMA18.转化酿酒酵母JG110 7后 ,用 2 %乙醇和2 %甘油联合诱导表达 .ELISA分析表明 ,在诱导 14h~ 30h期间 ,hAGN获得了表达并分泌至细胞外 .发酵上清液经 75 %饱和度硫酸铵沉淀、CM 5 2纤维素离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析纯化 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物重组人血管抑制素 (rhAGN)相对分子质量约 5 0kD ,电泳纯度达到 94 %.生物活性分析证明 ,rhAGN在 0 0 1mg L~ 3 0mg L浓度范围内能够抑制人真皮内皮细胞株HDMEC增殖 ,抑制作用随剂量的增加而增强 . 相似文献
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用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素 总被引:13,自引:0,他引:13
为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P.pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P.pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P.pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P.pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示:组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg/L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70%,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86%。CAM分析和抗癌实验结果显示:P.pastortis GS115(pGA.P9K-S)和P.pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL/6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90.61%和90.54%。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P.pastoris中表达AS及其他外源蛋白。 相似文献
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Saccharomycescerevisiaeisanindustrialstrainwidelyusedintheproductionofethanol,breweryandsinglecellprotein(SCP).Butitisunabletofermentstarchduetothelackofamylolyticenzymes.Thestarchmustfirstbecooked,liquifiedandconvertedintoglucoseandthenutilizedincommer… 相似文献
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地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达 总被引:8,自引:1,他引:7
采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。 相似文献
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用六种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、BglⅠ、BglⅡ和SalⅠ对滑鼠蛇肝脏线粒体DNA(mtDNA)进行酶解。发现BglⅡ、PstⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和EcoRⅠ在滑鼠蛇肝mtDNA上分别有1、2、3、3和4个切点。SalⅠ不能切割滑鼠蛇肝mtDNA。根据滑鼠蛇肝mtDNA的单酶、双酶完全酶解及部分酶解片段的数目和分子量,建立了滑鼠蛇肝mtDNA的限制酶图谱。 相似文献
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将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍. 相似文献
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在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖 (76mg/L),甲醇(57mg/L)。 根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF 诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。 相似文献
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枯草杆菌具有安全性好、产胞外蛋白、产品
中不含内毒素等优点。,14,201,是基因克隆的理想
受体,但也存在某些外源基因不能表达、用鸟枪
法克隆外源基因比较困难等缺点[113,16,181。若能
构建可在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达的
双功能质粒作为载体,以大肠杆菌为中间寄主,
利用其转化率高,克隆技术比较成熟的优点,先
将DNA片段克隆至大肠杆菌,经过鉴定后再
转至枯草杆菌中表达,则可克服枯草杆菌克隆
系统的以上缺点,有实际应用价值。目前,国外
已利用金黄色葡萄球菌质粒与大肠杆菌质粒重
组构建了一些双功能质粒115,1si,并已通过大肠
杆菌为中间宿主的方法将乙型肝炎病毒核心抗
原、口蹄疫病毒主要抗原117,及人干扰素。0i等基
因转人枯草杆菌中表达。本文描迷了作者之一
等分离的短小芽抱杆菌抗四环素质粒PC J 3121
和大肠杆菌质粒pBR 322分别用Bam HI和
Ava I双酶切,除去部分DNA片段后重组构
建双功能质粒pCB33的实验,并对其性质进行
了研究。 相似文献