多核苷酸合成的研究 ⅩⅣ.EcoRI接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氮酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS 引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

寡糖8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸衍生物在毛细管区带电泳中迁移时间相互关系

确定了寡糖８－氨基萘基－１,３,６－三磺酸（ＡＮＴＳ）衍生物在毛细管区带电泳中迁移时间的相互关系．分别将葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖和甲壳质部分酸水解产生的不同聚合度寡糖的混合物,用ＡＮＴＳ胺化还原衍生,然后用毛细管电泳,在５０ｍｍｏｌ／Ｌ,ｐＨ２．５磷酸缓冲液中分离衍生物,分别得到１至２１个聚合度的寡聚葡糖衍生物电泳梯度图,以及聚合度均为１至７的寡聚甘露糖、寡聚木糖和寡聚Ｎ－乙酰氨基葡糖衍生物电泳梯度图．同类寡糖衍生物相对迁移时间（ｔｍ）ｒ与聚合度ｎ均成线性关系．寡聚葡糖衍生物相对迁移时间与其他３类寡糖衍生物的相对迁移时间存在线性关系     

液相色谱-电喷雾质谱法分析牛胰核糖核酸酶B酶解肽谱,糖基化位点及糖型

糖蛋白分析一直是蛋白质分析鉴定的难点, 为建立准确灵敏的糖蛋白分析方法。采用液相色谱电喷雾质谱法（ＬＣＥＳＩＭＳ） 对糖蛋白———牛胰核糖核酸酶Ｂ（ＲＮａｓｅ Ｂ）的酶解肽谱进行分析, 证实其一级结构。通过比较糖苷酶处理酶解肽段前后的肽谱, 确定糖基化位点, 并通过串联质谱（ ＭＳ／ＭＳ） 解析了Ａｓｎ 连接的糖型结构及去糖后肽段的氨基酸序列。糖型结构经α甘露糖苷酶处理和质谱分析确定为高甘露糖型。此外, 还对糖型不均一造成的几种糖肽进行了相对定量。这一方法在ｐｍｏｌ 水平上, 同时分析糖蛋白的一级结构和糖结合位点及糖型, 对含Ｎ糖链的糖蛋白的分析具有普遍意义。     

脊髓灰质炎病毒合成肽的免疫诱导作用

 本文报道了模拟脊髓灰质类Ⅰ型病毒Mahoney株外壳蛋白的氨基酸顺序,用化学方法合成了位于VP1 70～75、95～102、93～103、70～75+93～103和VP 3132～143的五段肽。合成的肽段与载体蛋白偶联后免疫家兎能产生明显的免疫记忆作用。结果表明这些合成肽均能被脊髓灰质炎多克隆抗血清所识别,具有一定的免疫原性。     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氨酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB 呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI 修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB 去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB 时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶在构象上的差别以及亚基的相互作用

(1)用硫酸铵分级,然后磷酸纤维素亲和层析得到了均一的蛇肌醛缩酶,凝胶过滤法测定全酶分子量为160,000,SDS-凝胶电泳法测定了它的亚基分子量为40,000,表明蛇肌醛缩酶是一个四亚基的酶,它属于醛缩酶Ⅰ-A 型。(2)甲醇或尿素对蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶的影响是不同的。当用胰蛋白酶分别消化蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶时,发现蛇肌醛缩酶对胰蛋白酶的作用更为敏感。甲醇或尿素对酶活性影响的结果说明蛇肌醛缩酶有更紧密的构象,酶分子内部的疏水键在维持活化型时起着重要的作用,在低有机溶剂浓度时不受影响,而在高有机溶剂浓度时分子内部疏水键才遭到破坏。此外蛇肌醛缩酶分子表面的极性基团,包括赖氨酸和精氨酸形成的离子对可能更易受到胰蛋白酶作用,同时它们可阻止低浓度甲醇与酶分子内疏水键作用。(3)醛缩酶和TNBS 之间的反应支持酶分子的氨基,尤其是蛇肌醛缩酶的氨基在维护其天然构象中起着特殊作用的观点。(4)虽然蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶的构象有一定的不同,但是仍然能够进行杂交产生蛇肌-兔肌醛缩酶杂交株组,说明它们亚基之间的结合区域的差别并不很大。