表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。     

引发医院感染表皮葡萄球菌生物被膜的检测

为了解引发医院感染的表皮葡萄球菌中ica操纵元的存在与生物被膜的产生的关系及其对抗生素敏感性的影响,收集了引发医院感染的表葡萄球菌106株,采用定量和定性法检测生物被膜的产生,PCR法检测ica操纵元基因的存在以及测量细菌对红霉素（ERY）、氨苄青霉素（AMP）、头孢西丁（FOX）、头孢曲松（CRO）、替考拉宁（TEC）、环丙沙星（CIP）、四环素（TCY）、复方新诺明（SXT）、万古霉素（VAN）的最小抑菌浓度（MIC）;106株表皮葡萄球菌分离株中,有33株检测出icaABC（31．1％）;ica^＋菌中产膜菌的检出率高于ica^＋菌（P=0．001）;葡萄糖和NaCl可提高产膜菌的检出率;ica^＋浮游菌对红霉素,头孢西丁和头孢曲松的耐药率高于ica^＋浮游菌株,但对氨苄青霉素,环丙沙星,四环素和复方新诺明的耐药率与ica^＋菌相似;ica位点基因的存在与引发表葡菌医院感染密切相关,但生物被膜内菌耐药机制还需进一步研究。     

细菌生物被膜对抗生素耐药机制的研究进展*

细菌生物被膜引发的感染已成为医院感染的主要原因之一,具有耐药性和难治性的特点,引起了基础和临床研究的极大关注。但是细菌生物被膜对抗生素的耐药机制目前还不十分明确,对近年来生物被膜怎样和为什么会对抗生素如此耐药形成了几种可能机制进行综述。     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的:克隆结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法:采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:获得了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87%。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆、序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的Vero-E6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kb cDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76-118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%.将该基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物为GST-NP融合蛋白.SDS-PAGE检测表达蛋白分子约72kD左右.Western blotting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76-118株相比存在某些差异.     

汉滩病毒M、S基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白 (NP)部分片段以不同方式拼接 ,构建G1S0 .7或S0 .7G1嵌合基因 ,分别插入杆状病毒表达载体 pFBD ,转化DH10Bac致敏菌 ,获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid ,用其转染Sf9细胞 ,快速筛选出含有G1S0 .7或S0 .7G1嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白。利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果表明 ,含G1S0 .7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,其分子量约 97kD ;含S0 .7G1嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白 ,只能被抗汉滩病毒核蛋白特异性单抗所识别 ,其分子量约 4 3kD。上述结果提示 ,G1S0 .7嵌合基因可能在昆虫细胞中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白 ,S0 .7G1嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整 ,且生物学活性不如G1S0 .7嵌合基因的表达产物     

结核分枝杆菌RD1区研究进展

RD1区是结核分枝杆菌(MTB)在长期传代过程中丢失的重要保护性抗原,RD1区仅存在于致病性分枝杆菌中,而在卡介苗(BCG)及环境分枝杆菌中缺失。RD1区基因全长9.5kb,共有9个开放读码框,分别编码9个蛋白。RD1区是MTB毒力的关键因素之一,同时RD1区存在一种新分泌表达体系,能保证ESAT6和CFP10蛋白分泌表达。RD1区蛋白有较强的免疫原性,在MTB的预防和诊断中将可能发挥巨大作用,并有可能成为筛选抗MTB药物的理想靶抗原。