假单胞菌M18株pltZ基因转录阻抑藤黄绿菌素ABC转运系统

假单胞菌（Pseudomonas sp.）M18株的藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt )生物合成基因簇下游存在一个Plt生物合成负调控基因pltZ和一个负责Plt分泌及自身抗性的ABC（ATP_binding cassette）转运系统基因簇。利用启动子探针载体pME6015和pME6522分别构建ABC转运基因pltH与lacZ的翻译和转录融合表达质粒pHZLF和pHZCF,分别引入野生型假单胞菌M18株和pltZ突变菌株M18Z。半乳糖苷酶活性的测定结果表明：在pltZ突变株M18Z中,pltH’-‘lacZ翻译融合表达水平约比野生型提高3.7～8.4倍,pltH’‘lacZ转录融合表达水平显著提高了2.8～7.4倍,表明pltZ 能在转录水平上阻抑Plt ABC转运系统的表达,pltZ很可能通过阻抑Plt ABC转运系统的表达,间接地负调控Plt的生物合成。     

高产洛蒙真菌素洛蒙德链霉菌高通量筛选方法的建立与复合育种

[背景]洛蒙德链霉菌S015能生物合成具有广谱抗菌活性的吩嗪类化合物洛蒙真菌素。[目的]因S015菌株的洛蒙真菌素产量较低,将S015菌株经复合诱变育种和基因工程改造,提高洛蒙真菌素产量。[方法]建立洛蒙真菌素产生菌的高通量筛选方法,对出发菌株S0 15进行常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术和紫外复合诱变,筛选得到高产菌株;并在高产菌株上敲除洛蒙真菌素的前体分支酸竟争途径中的关键基因trpE1、trpE2,再过表达全局调控基因afsR。[结果]利用洛蒙真菌素在紫外波长375 nm处的特征吸收峰,以及洛蒙真菌素浓度和375 nm处吸光度值的正相关关系,建立了基于24孔深孔板发酵和酶标仪快速检测的高通量筛选方法。经过6轮ARTP和紫外复合诱变及高通量筛选,从4 320株突变株中筛选得到遗传稳定的高产菌株M6,其洛蒙真菌素的产量为61.33 mg/L,是S015菌株的7.35倍;M6菌株的分支途径基因trpE1、trpE2双敲株的洛蒙真菌素产量为81.89 mg/L,是S015菌株的9.82倍;在该基因工程菌株中过表达全局调控基因afsR,产量为109.53 mg/L,是S015菌株的13.13倍。[结论]建立的高通量筛选方法可以有效筛选高产洛蒙真菌素的突变株,并且操作简单快速。通过ARTP和紫外复合诱变,结合高产株M6的基因工程改造,能进一步提升洛蒙真菌素的产量。     

微生物源农用抗生素的研发与高产策略

开发高效、低毒、低残留的绿色农药是农药研发的发展趋势,其中微生物源农药抗生素占据了重要地位.随着基因组学、代谢工程和高通量筛选等技术的发展,新型微生物源农用抗生素的研究进入了新的阶段.文中简要总结了近10年来研发的新型微生物源农用抗生素的种类、农用抗生素产生菌株的高产育种与发酵研究策略等,为未来农用抗生素的研发提供参考...     

假单胞菌H78中全局调控蛋白Crc对Plt生物合成及其基因表达的调控

【目的】研究Pseudomonas protegens H78中全局调控蛋白Crc对藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt)生物合成及其基因表达的调控。【方法】通过同源重组方法无痕敲除crc基因,并将H78Δcrc突变株与H78野生株在KMB培养基中发酵测定Plt产量;采用lac Z报告分析研究Crc对plt合成基因表达的调控。【结果】突变株H78Δcrc的Plt产量显著下降;Crc在整体水平、转录水平及转录后水平均正调控plt合成基因的表达。【结论】全局调控因子Crc对Plt合成及基因表达表现为正调控作用。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp．)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的1．5kb片段,中间插入编码Km‘的DNA片段,获得rsmA^-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R^-。突变株M18R^-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20％。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

RNA聚合酶σ^38亚基缺失对假单胞菌抗生物质合成代谢的影响

设计引物从假单胞菌M18基因组DNA中扩增并获得rpoS基因的378bp保守区段。以此为探针,从假单胞菌基因组文库中克隆了包括rpoS基因全序列及其相邻序列的3·1kbEcoRⅠ-XhoⅠ片段。通过抗性基因(抗庆大霉素基因)的定点插入构建了σ38亚基缺失突变株M18S。HPLC检测结果显示,σ38亚基缺失引起该菌株的抗生物质合成代谢的显著变化。与野生株相比,缺失突变株的吩嗪-1-羧酸在PPM和KMB中2种培养基中合成量由58μg/mL和10·2μg/mL分别减少到20·4μg/mL和0μg/mL;而缺失突变株的藤黄绿脓菌素则相反,在PPM和KMB两种培养基中合成量由0·5μg/mL和20·5μg/mL分别提高到75·4μg/mL和185·6μg/mL。表明σ38亚基可区别性调控假单胞菌M18的抗生物质合成代谢。rpoS基因的互补实验和两种抗生素基因与β-半乳糖苷酶基因的翻译融合表达实验进一步验证了上述的结果:σ38亚基正调控吩嗪-1-羧酸的表达,而负调控藤黄绿脓菌素的表达。     

过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶及优化碳源高产洛蒙真菌素

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌S015合成的天然吩嗪类化合物,该化合物具有广谱抑菌活性及抗肿瘤活性,但因其在野生菌株中的产量较低而限制了应用.为了提高洛蒙真菌素产量,探究相关基因功能及S015菌株发酵条件,本研究首先建立系统进化树分析内源S-腺苷甲硫氨酸合成酶MetK,其次在野生型S015中过表达metK基因,最后通过动态发酵实验进行碳源优化.研究结果表明,过表达metK基因的菌株洛蒙真菌素产量达到(27.4±2.8)mg/L,是野生株的2.3倍;通过发酵优化,以20 g/L的木糖为碳源时洛蒙真菌素产量最高,为(130.6±8.0)mg/L,是优化前的4.8倍.本研究成功采用上游基因工程改造结合下游发酵优化的生物工程手段,有效地提高了菌株S015中洛蒙真菌素的产量.     

温度对假单胞rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白(Repressor of secondary metabolite,Rsm)A是一种全局性调控因子,与mRNA的RBS结合,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术,构建了假单胞茵(Pseudomonas sp．)M-18的rsmA突变菌株M-18R。在37℃、28℃恒温和短期升温(37℃、4h培养,转28℃继续培养)条件下,比较野生株M-18和突变株M-18R生物合成藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)的量。在37℃条件下,M-18和M-18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在28℃条件下,M-18R合成P11的量约为野生型M-18的10倍,达到270μg／mL,但是合成PCA的量仅为野生型的50％。经短期升温培养,M-18的Plt合成量明显下降,PCA产量降低不显;相反,M-18R合成Plt的量达到400μg／mL,但PCA产量的变化仍不明显。推测,M-18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子,在RsmA缺失条件下,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成,但是,并不参与对PCA合成的调控。     

基于ARTP诱变和高通量筛选的绿针假单胞菌GP72育种方法

【目的】绿针假单胞菌GP72是一种植物根围促生细菌,其分泌的次级代谢产物2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)具有广谱抗真菌活性,但其产量较低,不能满足农业生产的应用需求,因此需对GP72进行改造,从而提高产量。【方法】从GP72的野生株出发,首次将2-OH-PHZ合成途径的限制性因子Phz O用绿色荧光蛋白(GFP)替换,以一种新型的常压室温等离子体技术(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变,通过酶标仪测定96孔板中突变株的荧光强度进行高通量筛选;最后将荧光强度高的菌株中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)替换为Phz O以获得2-OH-PHZ高产突变株。【结果】经过五轮诱变后,获得一株荧光强度增加1.62倍的突变株,用phz O基因回替后,该突变株在KB培养基中摇瓶培养时2-OH-PHZ的产量为野生型的4.62倍。【结论】基于安全、高效ARTP诱变技术,并以GFP替换限制性因子作为标记进行高通量筛选,可以快速获得高产2-OH-PHZ的GP72突变株,克服了传统诱变育种方法筛选难度大、费时费力的不足,为其它微生物的育种提供了参考。