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外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新策略 总被引:3,自引:0,他引:3
大肠杆菌是最常用的遗传工程宿主 ,但是 ,外源蛋白在大肠杆菌中表达 ,往往形成包含体。包含体的形成 ,在一定程度上限制了原核载体 宿主系统的应用 ,为了克服包含体的形成 ,目前常用的策略是分子伴侣 (如GroEL ES、DnaK)、折叠酶系 (如DsbABC、PPI)、“分子内伴侣”(如Thrx、GST、SPA等 )甚至一些短肽的共表达或融合表达 ,上述策略虽然可以减少甚至完全避免包含体的形成 ,但都存在一定的缺点 ,如分子伴侣的作用存在明显的蛋白特异性 ,对不同蛋白辅助折叠效率不一样 ,对有的蛋白 ,甚至根本就不起作用 ,表现出… 相似文献
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合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
以pBV220为载体,进行了合成可溶型人干细胞因子(SCF)cDNA在大肠杆菌中的温控型的高效表达。SDS-PAGE检测表明,在实验室摇瓶培养中,目的蛋白可占菌体可溶蛋白的40%左右。表达产物复性后,经过凝胶过滤、离子交换层析,得到了电泳纯的重组rhSCF,经测定,纯化的rhSCF相对分子质量为19000,氨基端15个氨基酸的序列与天然可溶形式的hSCF成熟分子的序列完全一致。 相似文献
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目的:建立一种NADH依赖型酶活性检测的方法。方法:将FDH、LeuDH串联克隆到表达载体pET-22b(+)中,转化至E.coli,并向培养液中分别添加去离子水、甲酸胺、三甲基丙酮酸,反应一段时间后,检测NADH的吸光度。同时通过测定氨气的产生判断FDH活性;通过薄层层析检测判断LeuDH活性;比较NADH吸光度测定结果与常规方法结果是否一致。结果:通过测定氨气的产生,证明FDH具有活性;此时NADH吸光度上升亦说明FDH具有活性;两种方法结论一致。薄层层析检测,生成叔亮氨酸,证明LeuDH具有活性;此时NADH吸光度下降亦说明LeuDH具有活性;两种方法结论一致。结论:通过检测菌体内部NADH吸光度的变化检测NADH依赖型酶活性的方法可行。 相似文献
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【目的】克隆表达炭疽芽胞杆菌BlsA的功能区片段并对其生物学功能进行鉴定。【方法】以炭疽芽胞杆菌A16R基因组DNA为模板PCR扩增bslA(260-652)基因片段,克隆至pET-28a(+)载体。将成功构建的重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导表达后收集菌体经超声破碎后,对可溶表达部分用镍柱进行亲和层析纯化。以纯化后的蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备该蛋白的多抗,用ELISA和Western blot检测抗血清;使用间接免疫荧光实验和细菌黏附实验研究目标蛋白及其抗体的生物学功能。【结果】BslA(260-652)获得了可溶性表达,纯化后纯度约为87.4%。以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备的抗血清ELISA效价可达1∶20000。将BslA(260-652)蛋白与Hela细胞共孵育后,能够直接和Hela的细胞膜结合。细菌黏附实验表明BslA(260-652)蛋白及其相应的多抗血清都能够显著地抑制炭疽芽胞杆菌A16R对Hela细胞的黏附。【结论】大肠杆菌表达得到的炭疽芽胞杆菌BslA(260-652)蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性,为深入研究BslA蛋白在炭疽芽胞杆菌致病过程中的作用奠定实验基础。 相似文献
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目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryAIII基因。方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryAIII及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:NdeⅠ、HindⅢ分别酶切质粒pET-m28a/eryAIII-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryAIII编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加。结论:GroELS提高了eryAIII编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。 相似文献
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目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶胞内荧光检测方法。方法:利用EGFP分子内合适位点可以插入一定长度外源片段而不影响荧光性能的特性,构建EGFP分子内插入NS3/4A蛋白酶识别序列NS5AB的EGFP-5AB重组分子。将EGFP-5AB与NS3/4A蛋白酶共表达,若短肽链被切断,则EGFP的两个部分解离,荧光消失,从而可以监测HCV NS3/4A蛋白酶的存在。通过将NS5AB插入三种不同位点,寻找最合适的插入位点;将EGFP-5AB转染进入不同宿主细胞,验证其在不同细胞的表达情况并选择最佳宿主细胞。结果:确定EGFP 173-174氨基酸位点是合适的插入位点;确定CHO-K1为理想的荧光检测系统宿主细胞;在构建的细胞模型中,能够检测到EGFP被切割后的条带,但检测不到荧光信号,说明EGFP-5AB蛋白被有效切割,该方法可以检测到NS3/4A丝氨酸蛋白酶的存在。结论:成功构建了一种在哺乳动物细胞中检测NS3/4A蛋白酶切割活性的荧光检测方法。 相似文献
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目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryA Ⅲ基因.方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryA Ⅲ及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达.结果:NdeⅠ、Hind Ⅲ分别酶切质粒pET-m28a/eryA Ⅲ-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryA Ⅲ编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加.结论:GroELS提高了eryA Ⅲ编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础. 相似文献