敲低CTCF腺病毒表达载体的构建及效果检测

目的:获得敲低效果较好的CCCTC结合因子(CTCF)的RNA干扰腺病毒载体,以便于研究其在肿瘤发生发展中的作用。方法:从已发表文献中获得CTCF敲低靶序列,合成2对含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其进行退火磷酸化后,分别克隆到腺病毒包装载体上;将重组质粒转染人胚肾293A细胞,收获腺病毒;将收获的腺病毒分别感染人胚肾HEK293细胞和靶细胞人肺腺癌细胞A549,通过RT-PCR和Western印迹鉴定相关基因的表达变化。结果与结论:RT-PCR和Western印迹鉴定显示构建的表达CTCF短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体能够有效抑制CTCF转录和蛋白水平,为后续CTCF的生物学功能和机制研究奠定了基础。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

硫酯酶结构域对酮内酯类化合物合成的影响

在I型聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)中,硫酯酶结构域(Thioesterase,TE)负责将聚酮长链从PKS上水解下来,并协助环化为大环内酯环.分别将红霉素TE、ACP6-TE和苦霉素模块6(PikM6)基因转入糖多孢红霉菌KR6突变体中表达,仅PikM6显著促进酮内酯类化合物的合成,表明TE只有融合于模块中才能充分发挥硫酯酶的功能.     

pcD-awte候选疟疾DNA疫苗发酵条件的探索

探索pcD-awte候选疟疾DNA疫苗发酵条件,为该疫苗制备工艺的建立做准备.通过摇瓶和5 L发酵罐水平,考察不同培养基组成及来源、补料变化和温度转换对工程菌生长及质粒产量的影响.结果表明在TB培养基组分中添加Mg2+、微量元素复合物、核苷等成分,补料培养基由葡萄糖代替甘油,对数中期温度由37℃升至42℃等条件,能提高工程菌株pcD-awte质粒的产量.在优化的培养条件下pcD-awte质粒产量可达125～130mg/L培养液.     

红霉素基因工程研究进展

红霉素是一类广谱大环内酯类抗生素 ,在临床上具有广泛的应用。近 10年来用基因工程方法对红霉素结构改造已经取得了很大的进展。通过基因工程不仅可以改造红霉素内酯环环的大小、环的骨架和环的侧链 ,而且可以对后修饰的羟基、糖基和甲基进行改造。迄今用基因工程方法合成的新的大环内酯环结构已超过 10 0种 ,所合成的各种红霉素类似物也有数十种 ,且经过基因改造的红霉素类似物都具有生物活性。但基因工程产物产量都普遍降低 ,抑菌活性也不理想 ,因此未来红霉素基因工程研究的重点应加强产量和高活性结构筛选的研究。     

合成酮内酯类3—脱氧—3—羰基—红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约3.2kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M（1－8）。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3－脱氧－3－羰基－红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。     

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌热稳定肠毒素(ST）的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二的不同是,前为单拷贝ST,后为双拷贝ST。在大肠杆菌DH50α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。     

单染色体靶向富集方法的建立

靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性,只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段,本研究以21号染色体为例,采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下：（1）首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M 期,制备染色体悬液;然后流式分选出21号单染色体。（2）采用多重退火环形扩增技术（MALBAC）对21号染色体DNA进行扩增;用扩增的DNA产物构建文库。（3）利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交,捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明,特定的21号染色体呈上百倍的富集,而靶标文库则富集了近60 倍。结果提示,特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集,用于单条染色体功能组学研究,而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常（如DNA突变、异位、重复及倒置等）,具有一定的实用意义。     

3-脱氢莽草酸生物合成的代谢工程

3-脱氢莽草酸,是芳香族氨基酸生物合成代谢途径中一种重要的中间产物,可作为一些化学合成制剂和药物中间原料。这样以无毒可再生物质为起始原料的合成方法与传统的有机合成化学制剂的方法相比,对环境更加有利。此外,它还是一种十分有效的抗氧化剂。工业上一般采用化学合成法和发酵法来生产3-脱氢莽草酸,随着代谢工程的兴起,使得更加理性改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。本文主要介绍了代谢工程在生物合成3-脱氢莽草酸生产菌改造中的应用情况,其中涉及3-脱氢莽草酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中心代谢途径的改造和3-脱氢莽草酸合成支路的修饰等,并探讨了将来的发展前景。