前体代谢工程提高红霉素产量的研究进展

红霉素是十四元大环内酯类抗生素,具有广泛的医药价值和巨大的新药开发潜力。红霉素的主要成分红霉素A由丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A作为前体通过聚酮合酶合成大环内酯骨架,再经羟基化、糖基化、甲基化等一系列修饰合成。根据红霉素A的生物合成路线,我们从前体喂养途径、糖基化和甲基化优化等方面,简要综述近年来利用前体代谢工程手段提高红霉素产量的研究进展。     

天蓝色链霉菌代谢物组测定方法优化及其代谢特征

链霉菌能够产生多种抗生素,具有重要的研究与应用价值。代谢物组学能够定性和定量测定胞内外主要低分子量代谢产物。相对于其他组学,代谢物组学在监控胞内代谢状态、指导物种理性改造方面具有独特优势。本文旨在建立一种快速、准确的链霉菌胞内代谢物分析方法。以模式菌株天蓝色链霉菌为研究对象,基于GC-MS分析平台优化了代谢物组学样品制备流程中的细胞淬灭时间、菌体分离方法、代谢物提取及代谢物衍生化条件,并利用该方法对天蓝色链霉菌不同生长时期各代谢途径的相对活性进行了初步分析。采用"低温淬灭(–40℃,4 min)-快速过滤分离-反复冻融(45 s/3 min)-衍生化(40℃,90 min)"的流程能够鉴定出中心代谢途径(糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环)、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、核酸代谢途径及部分次级代谢途径中的103种主要代谢物。利用该流程测定发现天蓝色链霉菌细胞生长周期中存在显著的代谢时序差异,并且发现氨基酸与脂肪酸代谢在衔接初级代谢与次级代谢生物合成中具有重要作用。本研究建立的测定方法能够有效地用于天蓝色链霉胞内代谢物分析,该方法将有助于深入刻画链霉菌细胞代谢过程,为菌株代谢工程改造增加次级代谢产物产量提供理性指导。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

siRNA的体内递送

siRNA是一种由siRNA介导的转录后基因沉默。自利用RNAi沉默目的基因获得成功以来, 体内应用RNAi的研究受到高度重视。由于siRNA本身的不稳定性以及体内的复杂环境, siRNA递送的安全性与有效性成为目前关注的重点。文章就目前报道的siRNA体内递送方式进行了综述。     

合成酮内酯类3—脱氧—3—羰基—红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约3.2kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M（1－8）。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3－脱氧－3－羰基－红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。     

pcD-awte候选疟疾DNA疫苗发酵条件的探索

探索pcD-awte候选疟疾DNA疫苗发酵条件,为该疫苗制备工艺的建立做准备.通过摇瓶和5 L发酵罐水平,考察不同培养基组成及来源、补料变化和温度转换对工程菌生长及质粒产量的影响.结果表明在TB培养基组分中添加Mg2+、微量元素复合物、核苷等成分,补料培养基由葡萄糖代替甘油,对数中期温度由37℃升至42℃等条件,能提高工程菌株pcD-awte质粒的产量.在优化的培养条件下pcD-awte质粒产量可达125～130mg/L培养液.     

单染色体靶向富集方法的建立

靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性,只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段,本研究以21号染色体为例,采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下：（1）首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M 期,制备染色体悬液;然后流式分选出21号单染色体。（2）采用多重退火环形扩增技术（MALBAC）对21号染色体DNA进行扩增;用扩增的DNA产物构建文库。（3）利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交,捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明,特定的21号染色体呈上百倍的富集,而靶标文库则富集了近60 倍。结果提示,特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集,用于单条染色体功能组学研究,而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常（如DNA突变、异位、重复及倒置等）,具有一定的实用意义。     

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌热稳定肠毒素(ST）的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二的不同是,前为单拷贝ST,后为双拷贝ST。在大肠杆菌DH50α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。     

NADH依赖型酶活性检测方法的建立

目的:建立一种NADH依赖型酶活性检测的方法。方法:将FDH、LeuDH串联克隆到表达载体pET-22b(+)中,转化至E.coli,并向培养液中分别添加去离子水、甲酸胺、三甲基丙酮酸,反应一段时间后,检测NADH的吸光度。同时通过测定氨气的产生判断FDH活性;通过薄层层析检测判断LeuDH活性;比较NADH吸光度测定结果与常规方法结果是否一致。结果:通过测定氨气的产生,证明FDH具有活性;此时NADH吸光度上升亦说明FDH具有活性;两种方法结论一致。薄层层析检测,生成叔亮氨酸,证明LeuDH具有活性;此时NADH吸光度下降亦说明LeuDH具有活性;两种方法结论一致。结论:通过检测菌体内部NADH吸光度的变化检测NADH依赖型酶活性的方法可行。