结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片的制备

目的：利用克隆表达的7种结核分枝杆菌优势表位抗原,建立可视化抗体检测蛋白芯片,用于结核病辅助诊断。方法：将7种结核分枝杆菌优势表位抗原,即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3点于修饰的基片上,制备可检测7种结核抗体的多靶点蛋白微阵列,建立免疫金银染色检测系统;使用该芯片对48例临床结核病患者血液样品进行检测,并与“金标准”痰涂片（48例）和痰培养（其中的29例）检测结果进行比较,分析其敏感性;对30名献血员血液样品进行检测,分析其特异性。结果：可视化抗体检测蛋白芯片的敏感性分别为98.5％和96.6％,而痰涂片和痰培养检测方法的敏感性分别为35.4％和48.3％;可视化抗体检测蛋白芯片的特异性为93.3％。结论：建立的结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片检测敏感性显著高于痰涂片和痰培养方法,可用于结核病的临床辅助诊断,提高痰涂片和痰培养假阴性的检出率。     

结核分枝杆菌Rv3871抗原优势肽段的克隆表达及抗原性鉴定

目的:为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,克隆表达结核分枝杆菌H37Rv株RD1区Rv3871抗原优势肽段,并应用ELISA法对其抗原性进行初步鉴定。方法:利用Biosun生物信息学软件对Rv3871抗原进行表位分析,通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3871抗原优势肽段编码基因,在大肠杆菌HB101中进行表达,采用间接ELISA法初步评价其抗原性。结果:Rv3871-1肽段检测的敏感性为32.5%(13/40),特异性为97.2%(35/36);Rv3871-2敏感性为45%(18/40),特异性为100%;Rv3871-3敏感性为37.5%(15/40),特异性为91.6%。结论:结核分枝杆菌RD1区Rv3871抗原优势肽段Rv3871-2有较高的特异性和敏感性,有望作为候选抗原用于结核病患者的血清学检测。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用简

目的：建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法：用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值（均值＋3标准差）。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果：在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72．14％（51/70）;69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98．6％（1/69）。结论：建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

人IA-2基因的部分区段克隆表达及其在1型糖尿病诊断中的应用价值评估

目的:构建人IA-2基因不同区段原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,并初步验证其在1型糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体检测中的价值。方法:用RT-PCR方法调取目的基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白;以重组蛋白为包被抗原,初步建立检测蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体的ELISA方法,评价各片段在1型糖尿病诊断中的价值。结果:获得了2种可被1型糖尿病患者血清识别的重组人蛋白酪氨酸磷酸酶抗原区段IA-2(601～979)和IA-2(683～979),检测敏感性和特异性相当,但IA-2(683～979)检测的阳性D450nm值明显高于IA-2(601～979),成为首选的抗原区段。结论:所选重组人IA-2(683～979)抗原区段具有良好的抗原性,可作为1型糖尿病患者辅助诊断试剂的候选抗原。     

腺病毒55型抗原表位分析及评价

目的:筛选腺病毒55型(Ad55)抗原表位,为研制腺病毒免疫诊断试剂提供基础。方法:采用生物信息学方法预测Ad55六邻体、纤突的B细胞抗原表位;利用大肠杆菌优势密码子获得相应基因,插入载体pBVIL-1克隆表达后获得重组Ad55表位抗原;用临床疑似腺病毒呼吸道感染患者血清对重组Ad55表位抗原活性进行检测,用ROC曲线分析重组Ad55抗原的诊断意义;采用ClustalX软件进行多序列比较。结果:Ad55六邻体含有6个主要抗原表位,纤突含有2个主要抗原表位;采用退火延伸法获得上述8种表位基因,片段长度为90~180 bp;获得上述8种重组基因工程抗原,相对分子质量为18×103~21×103;血清学检测的ROC曲线分析显示,270~320、410~460和135~165氨基酸残基抗原表位的AUC面积超过0.75,具有一定的诊断意义(P0.05);序列比较结果显示,上述3种抗原表位与腺病毒11型序列高度同源,与3型存在较大差异。结论:获得了3个Ad55主要抗原,对研制通用性呼吸道传播腺病毒免疫诊断试剂具有一定的意义。     

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的:获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果:肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论:采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。     

丙型肝炎病毒准种血清学检测技术的建立

目的:建立一种以血清学为基础的丙型肝炎病毒(HCV)准种检测技术。方法:自20份HCV血清中各挑选30个克隆进行测序比较,分析HCV准种的复杂程度;以HCV准种代表性抗原组合制备免疫芯片,用血清学检测技术分析上述20份HCV血清中的准种变异程度;比较两种方法之间的检出灵敏度和相关性。结果:测序法检出灵敏度为70.0%,血清学检测法检出灵敏度为95.0%,后者显著高于前者(P0.05);两种方法检测结果的相关性为74.7%(P0.01)。结论:血清学检测技术操作简单,且能够反映丙型肝炎患者的HCV准种变异程度,适于临床推广。     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该栽体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究.     

丙型肝炎病毒诊断参考品的研究进展

体外诊断试剂的参考品是由逐一反复论证的一套样品所组成,用于全面控制试剂质量,它对于试剂应达到的各种指标提出了全面要求。目前国际上常用的丙型肝炎诊断试剂参考品为抗HCV抗体血清参考品和核酸检测参考品,我们简要综述了丙型肝炎病毒诊断试剂参考品的研制及发展。