高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶2同源基因的克隆、表达和活性分析

[背景] 高山被孢霉（Mortierella alpina）是一种可积累大量花生四烯酸（Arachidonic Acid,AA）的产油丝状真菌,其所产脂肪酸主要被组装到甘油骨架上以三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）形式存在。二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol Acyltransferase,DGAT）是TAG生物合成途径的关键酶,对于高山被孢霉TAG的生产具有重要意义。[目的] 通过探究高山被孢霉DGAT2在TAG生物合成方面的功能特点,以期为提高产油真菌的TAG产量及改善TAG的脂肪酸组成提供参考。[方法] 利用序列比对在高山被孢霉ATCC32222基因组中筛选出2个编码DGAT2的候选基因MaDGAT2A/2B,在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中异源表达后进行功能分析,并在外源添加AA条件下通过检测TAG产量进一步分析MaDGAT2A/2B的活性,最后在高山被孢霉中同源过表达MaDGAT2A/2B,通过检测重组菌总脂肪酸产量及组分以分析MaDGAT2A/2B的体内活性。[结果] MaDGAT2A在S. cerevisiae中异源表达时,重组酵母菌TAG的产量达到细胞干重的3.06%,为对照组的4.91倍;而MaDGAT2B未明显提高重组酵母菌TAG的产量。在外源添加AA时,MaDGAT2A/2B均可显著促进重组酵母菌中TAG合成,表达MaDGAT2A的重组酵母菌TAG含量为对照组的3.67倍,表达MaDGAT2B的重组酵母菌TAG含量为对照组的2.61倍。MaDGAT2A/2B在高山被孢霉中过表达对其总脂肪酸产量无显著影响,但可显著提高总脂肪酸中AA的含量,AA占总脂肪酸比例最高达到39.15%,相比对照组提高16.14%。[结论] MaDGAT2A/2B可以参与TAG的生物合成,表明2个候选基因编码的蛋白具有DGAT活性,并且可提高高山被孢霉脂肪酸中AA的含量,对于改善产油真菌的脂肪酸组成从而提高其应用价值具有重要意义。     

动物双歧杆菌肌球交叉反应抗原MCRA酶学功能的研究

目的:将肌球蛋白交叉反应抗原基因(Myosin cross reactive antigen,MCRA)在毕赤酵母中重组表达,对其酶学功能进行研究。方法:利用动物双歧杆菌BB-12(Bifidobacterium animalissubsp.lactis BB-12)的肌球交叉反应抗原(MCRA)基因序列特征设计引物进行PCR扩增后克隆至毕赤酵母表达载体pPinkα-HC,电转化获得PichiaPinkTM重组菌。通过SDS-PAGE和Westernblot检测重组蛋白的表达情况,GC-MS分析重组菌的脂质组成情况,最终确定重组蛋白的活性及其催化特性。结果:SDS-PAGE及Western blot结果表明动物双歧杆菌BB-12的MCRA蛋白在重组毕赤酵母菌PichiaPinkTMpPinkα-HC-MCRA中成功表达且定位至细胞膜,大小为82 kDa。GC-MS结果显示,添加底物亚油酸培养基后,重组菌将亚油酸转变为羟基化衍生物,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸(10-HOE)。结论:这是首次对该类蛋白成功定位后对其酶学功能进行研究,动物双歧杆菌BB-12的MCRA基因首次在毕赤酵母中实现了活性表达,产物为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。     

含被动关节的仿人型塑料电子假手研究

为了突破传统假手的不足,使假手在形状和功能上更像人手、重量进一步减轻,设计了包含被动关节的仿人型塑料电子假手。在健全手的帮助下,假手手指关节可被动弯曲和旋转;与传统单自由度假手相比,可以完成更加复杂的动作。仿真塑料假手样机重量较轻、外形美观,通过配置肌电控制系统实验,实现了对假手实现准确可靠的控制。     

高山被孢霉亚甲基四氢叶酸脱氢酶的克隆、表达和功能鉴定

叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸,此过程会生成NADH或NADPH。对高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明脂质合成所需还原力NADPH的来源。首先对MTHFD序列进行分析,并以pET28a（+）质粒为载体构建了MTHFD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用比色法分析酶反应产物,表明纯化蛋白质具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD⁺和NADP⁺均具有催化能力,但更偏好于将NADP⁺转化为NADPH。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调,表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用,很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。这为对高山被孢霉进行分子改造,使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供了理论依据。     

卷枝毛霉pyrG基因缺陷突变株的诱变筛选与鉴定

为制备新的遗传筛选标记用于构建高产番茄红素的工程菌株,实验运用化学诱变的手段,以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍为诱变剂,以番茄红素生产菌株卷枝毛霉MU616为出发菌株,诱变获得5株尿嘧啶缺陷型突变株,突变株在基本培养基中培养5天后仍不能生长。通过同源转化带有pyrG基因(编码乳清酸核苷-磷酸盐脱羧酶)的质粒pEPM1确定突变株Mt1、Mt4和Mt5为pyrG基因缺陷突变株。随之对pyrG突变株进行生长特性的研究和产番茄红素性能的检测,结果表明,其中突变株Mt4的生物量为(9.0±0.6)g/L,番茄红素产量在黑暗和光照条件下分别为(1 648±185)μg/g和(3 234±281)μg/g,均与出发菌株相似,适宜作为进行卷枝毛霉转化的带有遗传标记的受体菌。pyrG基因缺陷突变菌株的获得对构建高产番茄红素的卷枝毛霉工程菌具有重要的意义。     

一株降烟碱细菌的筛选、鉴定及其降解特性研究

以烟碱为唯一碳源,从湖南张家界烟草种植地的土壤中分离得到一株降解烟碱能力较好的菌株。经常规形态观察和生理生化实验结果表明,该菌为放射形土壤杆菌或根癌土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter／tumefaciens)。研究表明,该菌的降解烟碱最适pH和温度分别为7.0和30℃。该菌能够利用烟碱为唯一碳源,在含烟碱的培养基中发酵液呈淡黄色-绿色-墨绿色-深综色变化,培养48h后,烟碱的降解率可达71%,具有较好的烟草工业应用前景。     

健康与龋病口腔唾液中乳杆菌的发酵类群与表面性质

目的 研究口腔健康的成年人和龋病患者唾液中乳杆菌的发酵类群和表面性质。方法 糖酸以口腔健康的成年人和龋病患者为对象,取其早餐后2 h的无刺激全唾液分离乳杆菌,检验其对葡萄糖和葡萄糖酸钠发酵的情况;应用MATH（Microbiol Adhesion to Hydrocarbons）法测定菌体表面疏水性和电荷。结果 口腔健康的成年人与龋病患者唾液中乳杆菌各发酵类群的比例不同,前者表面疏水性和电荷比较高,后者比较低。结论 口腔健康的成年人和龋病患者唾液中乳杆菌的组成不同,表面性质也不同,特定种类的乳杆菌与龋病的发展相关。     

二羟丙氧甲基鸟苷(DHPG)体外抑制单纯疱疹病毒增殖的研究

二羟丙氧甲基鸟苷[9-(1,3-dihydroxy-2-Propoxymethyl)guanine,简称DHPG]是近几年合成的一种结构与无环鸟苷(ACV)类似的抗病毒化合物(图1)。已证明,它对单纯疱疹病毒1、2型(HSV-1、2),巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)具有较强的选择性抑制作用,尤以对CMV的作用,被认为是最有希望的抗CMV药物之     

纯化标签的不同位置对Δ6脂肪酸脱饱和酶异源表达的影响

【背景】目前利用酵母表达系统已鉴定了多种物种中的Δ6脂肪酸脱饱和酶(FADS6)。由于FADS6是一种具有多个跨膜螺旋的膜蛋白,使得其大量表达和纯化具有挑战性。【目的】探索FADS6的高效表达策略,研究纯化标签添加的位置对高山被孢霉FADS6I (Ma FADS6I)重组表达效率的影响。【方法】在毕赤酵母表达载体中插入串联亲和标签HRV 3C-Protein A-His,利用改造后的载体构建带有N端或C端标签的Ma FADS6I表达载体;通过电转化获得毕赤酵母重组表达菌株;利用斑点印迹杂交(DotBlot)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹(Western Blot)分析重组蛋白的表达水平,并利用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)分析检测Ma FADS6I催化生成的脂肪酸。【结果】通过大量的毕赤酵母转化子筛选,最终获得高效表达Ma FADS6I的毕赤酵母重组菌,证实各转化子的表达具有差异性,Ma FADS6I的C端带有纯化标签较N端更有利于表达。【结论】在Ma FADS6I的C端添加纯化标签比在N端添加更有利于该蛋白在酵母系统中的表达以及底物的转化,为进一步探究FADS6高效表达和结构功能奠定了基础。     

耐热重组β-半乳糖苷酶的制备及酶稳定性研究

编码嗜热脂肪芽孢杆菌β—半乳糖苷酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600／pMA5—bgαB,经5L发酵罐发酵收集菌体超声波破壁,冷冻离心后再经过热处理和盐析纯化,比活力达80．3U／mgpr,回收率73．6％,纯化倍数12．4倍。β—半乳糖苷酶在细胞内及破壁后都具有较好的稳定性,60℃热处理对酶构象的影响不大。