结核杆菌Hsp65 与人IL-2 融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的:构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs)。方法:用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含Hsp65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Western-blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果:重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000 bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论:成功构建了大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

色胺酮对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨色胺酮(Tryptanthrin,Try)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用MTT方法检测Try(1.56-100μmol/L)对细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞的形态学改变;流式细胞术检测细胞周期、凋亡情况及线粒体跨膜电位等指标。结果:MTT结果显示,Try在12.5-100μmol/L浓度范围内能明显抑制MCF-7细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性;透射电镜下可见Try作用48h后,MCF-7细胞有典型的凋亡样改变。Annexin V-FITC与PI双染,流式细胞仪检测结果显示:50、100μmol/LTry作用后,细胞的凋亡情况明显,与对照组相比差异显著;且影响了MCF-7的细胞周期分布,将细胞阻滞于G1期,抑制其DNA的合成;并导致细胞线粒体跨膜电位下降。结论:色胺酮能明显抑制MCF-7细胞增殖并具有诱导细胞发生凋亡的作用。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌（MTB）ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因（atg）分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。     

m6A RNA甲基转移酶METTL3对肠癌细胞上皮间质转化及侵袭能力的影响

摘要 目的：探讨METTL3对肠癌细胞上皮间质转化及侵袭能力的影响。方法：TGFβ诱导肠癌细胞HCT116和SW480发生上皮间质转化;细胞划痕实验和Transwell-Matrigeal穿膜试验分别检测细胞转移侵袭能力;实时荧光定量PCR检测靶基因转录水平;siRNA干扰技术敲减肠癌细胞METTL3水平。结果：细胞划痕修复实验表明：TGFβ诱导组相对愈合面积与对照组相比显著增大（P<0.0001）,而TGFβ+敲减METTL3联合组处理组相对愈合面积与TGFβ诱导组相比显著减少（P<0.0001）。Transwell-Matrigeal细胞穿膜试验表明：TGFβ诱导组穿膜细胞数较对照组细胞显著增多（P<0.0001）,而TGFβ+敲减METTL3联合组处理组与TGFβ诱导组相比显著减少。TGFβ诱导组可显著诱导肠癌细胞发生上皮间充质转化,即增加核心转录因子Snail1和ZEB1水平,减低CDH1及上调Vimentin（VIM）水平,METTL3表达随TGFβ处理时间逐步上调。TGFβ+敲减METTL3联合组较TGFβ诱导组ZEB1和Snail1转录水平显著减低。结论：METTL3在TGFβ介导肠癌细胞EMT中起到关键作用,敲减METTL3可削弱肠癌细胞转移和侵袭能力,靶向抑制METTL3可能成为干预结直肠转移的重要分子靶点。     

5-氨基酮戊酸光动力疗法体外抑制断发毛癣菌肉芽肿株增殖研究

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)对体外培养的断发毛癣菌肉芽肿株的杀伤效应。方法将临床Majocchi肉芽肿患者皮损分离培养出的断发毛癣菌肉芽肿株,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化后制备菌悬液,与5mmol/L ALA共孵育后荧光显微镜观察原卟啉PpⅨ(ProtoporphyrinⅨ,PpⅨ)产生情况。实验分对照组、单药组、单光组和ALA-PDT组。对照组无处理。ALA-PDT组断发毛癣菌与5 mmol/L ALA共孵育6h后,采用功率密度为40mW/cm2的633nm红光以不同能量密度(50、100、150、175、200J/cm2)照射。单药组断发毛癣菌与5mmol/L ALA共孵育6h,不照光。单光组无ALA共孵育,只给予200J/cm2红光照射。通过数码相机拍摄照片及菌浓度评估ALA-PDT对断发毛癣菌肉芽肿株生长的抑制效应。结果荧光显微镜下可见明显砖红色荧光物质PpⅨ产生,当照光能量密度为175、200J/cm2时,照片显示菌落生长明显受限,数量减少,菌浓度计数分别为(0.53±0.058)×105 CFU/mL、(0.13±0.057)×105 CFU/mL,明显低于对照组、单药组、单光组及其他低能量密度ALA-PDT组(P0.05)。结论 ALA-PDT对断发毛癣菌肉芽肿株有明确的杀伤效应,可为临床ALA-PDT治疗皮肤癣菌感染提供理论依据。     

新型中药栓塞剂介人治疗甲状腺机能亢进症的动物实验研究

目的：观察并评价新型中药栓塞剂介入治疗甲状腺机能亢进症的动物实验研究情况。方法：检测并分析新型中药栓塞剂介入治疗甲状腺机能亢进症的动物实验研究资料。结果：1．无菌检查：根据中国药典2（105版的灭菌检查方法,对经灭菌的样品进行厌氧菌、需氧菌检查,无上述菌落。2．热源检查：依据中国药典2005版规定的热源;险查方法,进行栓塞剂热源检查,结果表明无热源反应发生。3．溶血实验：溶血实验表明,栓塞剂在37℃保温24h后无溶血现象（红细胞全部下沉,上层液无色澄明）。4．栓塞剂使用后,动物无剧烈不良反应,无发音困难。术后5—7d开始脱毛、少叫、懒动、表情淡漠、反应迟钝、进食减少、体重减轻,呈甲状腺功能减低表现。5．血清B、T4、TSH及血钙水平均与实验前有显著差异（P〈0．05）。结论：我们研究的新型复方中药捡塞剂不但具有良好的栓塞效果同时具有抗炎、止血、痛等治疗作用,总之,复方中药栓塞剂有望成为介入治疗甲亢并能被普遍接受的新型固态栓塞剂,具有广阔应用前景。     

克隆绵羊——多莉(DOLLY)的研究进展

多莉,第一例大型克隆哺乳动物,由一只称为FinnDorset的6岁母羊乳腺体细胞的基础生命物质经细胞核转移等操作而产生。成果公布后,持怀疑观点的学者提出,提供体细胞的母羊是否本身处在妊娠状态?推测多莉是由胚胎细胞产生,并非体细胞本身克隆所致。由于6岁的母羊死于1995年,只能用其冷冻保存的乳腺组织在Hannah研究中心进行细胞群体的分析。首先,用微卫星扩增技术,以三套引物进行测定;其次,进行DNA指纹分析来断定供体体细胞起源,以确定多莉的真实性。最后证实多莉来自成年母羊乳腺的体细胞。     

自噬的形态特征及分子调控

自噬过程是生物进化过程中保留下来的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制,一般认为自噬过程对于细胞在恶劣环境下生存具有重要意义.而细胞的发育和凋亡与自噬有着密切的关系.本文通过自噬体的形成方式综述了三种自噬形式的形态特征以及自噬的分子调控对细胞的影响.     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中 的初步应用

目的:探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法:将已构建的含5种目的基因的表达载体(pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6),分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果:五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论:Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查

为探明贵州省近几年引起猪病毒性腹泻两个主要病原PEDV与PoRV的变异情况,本研究对贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、黔东南洲等5个地(州市)26个规模化养猪场采集了213份疑似腹泻的粪便样品,采用实验室建立的PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR检出PEDV阳性的病料12份和PoRV阳性病料4份。根据GenBank登录的PEDV和PoRV基因序列,分别设计PEDV M基因和PoRV VP7基因特异性引物,扩增目的基因、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:成功克隆了12株PEDV M基因(681 bp)和4株PoRV的VP7基因(981 bp),M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别在98.1%~100%和98.2%~100%之间,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别在97.4%~100%和97.3%~100%之间;VP7基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别为95.5%~99.7%和96.9%~99.7%,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别为71.9%~95.1%和72.7%~99.1%。贵州省PEDV地方流行株与疫苗株CV777、Attenuated DR13亲缘关系较远,PoRV地方流行株与G4型毒株Gottfried、HeN4等属于同一群。结果表明,本研究从分子流行病学角度证实了贵州省PEDV和PoRV流行与变异情况,为贵州省PEDV和PoRV合理的防控措施提供参考依据。