谷氨酸棒杆菌YILW苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质

将L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum YILW)苏氨酸脱水酶(threonine de-hydratase,TD)的编码基因ilvA在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以C.glutamicum ATCC13032、YILW的基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,测序获得编码序列。利用质粒PET-His将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达、金属螯合纯化,对其酶学性质进行初步研究。结果显示C.glutamicum YILW编码基因序列与已报道的ilvA序列相差5个碱基,相似度为99.6%,第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明:重组酶YilwTD最适反应温度为32℃,在20~55℃范围内该酶较稳定,最适pH为6.7,该酶底物专一性强,对最适底物苏氨酸的米氏常数Km=8.32 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.18×104U/mg,与野生型酶相比,突变(F383V)后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造L-异亮氨酸生产菌,提高L-异亮氨酸产量奠定了基础。     

运动调控昼夜节律在抗肌萎缩中的作用

随着全球老龄化进程加剧,老年人口剧增,伴随着工作和生活方式的改变,导致体育锻炼减少与生活作息不规律等问题愈发严重。这样的结果显著增加了骨骼肌萎缩的发病率,降低了老年和慢性疾病人群机体健康,影响其生活质量。与此同时,饮食不均衡和运动量降低以及激素水平波动等进一步加剧骨骼肌萎缩的发生,其病理机制主要为慢性炎症加重、线粒体功能障碍、自噬功能状态低下、细胞凋亡增加、肌卫星细胞功能受损以及昼夜节律紊乱等。其中,随着昼夜节律相关研究的深入,骨骼肌作为机体最大的外周生物钟,可通过调控昼夜节律核心基因BMAL1以及CLOCK基因,对骨骼肌纤维结构、线粒体功能、肌肉质量等产生影响。运动锻炼作为改善骨骼肌质量的重要干预策略,还可激活昼夜节律信号通路,调控其相位,进而改善肌肉再生、提高肌肉力量,发挥延缓肌萎缩作用。为此,本文从昼夜节律的角度去阐述其与肌萎缩发生以及潜在运动干预的分子机制,以期为肌萎缩的预防、治疗及康复提供新的靶向思路。     

纤维素乙醇统合加工过程中的酵母多酶共展示体系研究进展

利用统合生物加工过程(Consolidated bioprocessing,CBP)生产纤维素乙醇是目前国内外的研究热点。CBP需要一种“集成化”微生物,既能生产水解木质纤维素的多种酶类又能利用水解木质纤维素产生的糖类发酵产乙醇。以酿酒酵母表面展示技术为依托,建立CBP菌株多酶共展示体系的研究主要分为以下两个方向：一是直接将纤维素酶展示在细胞表面,即非复合型纤维素酶体系;另一种是通过表面展示纤维小体(Cellulosome)将纤维素酶间接地锚定在细胞表面,即复合型纤维素酶体系,本文主要从以上两个方向阐述了近几年对于纤维素乙醇生物统合加工过程的研究进展。因纤维小体对纤维素的降解能力比非复合型纤维素酶体系更强,所以其在酿酒酵母细胞表面的组装研究受到越来越多的关注,为了更深入透彻地了解纤维小体的酵母展示技术,文中对纤维小体的结构与功能及其在纤维素乙醇发酵中的应用研究进行重点论述,并对该领域的发展方向进行展望。     

固定化尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶联催化制备5′-胞苷酸

尿苷-胞苷激酶作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂，可以催化胞苷的磷酸化反应合成5′-胞苷酸 (简称胞苷酸)，但需要NTP作为磷酸供体。为了提高胞苷酸的生产效率，文中首先使用大肠杆菌分别异源表达来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles HB8的尿苷-胞苷激酶和来源于类球红细菌Rhodobacter sphaeroides的聚磷酸激酶，其中尿苷-胞苷激酶用于催化胞苷和ATP形成胞苷酸，聚磷酸激酶则用于ATP的循环再生。然后，使用D403金属螯合树脂吸附Ni2+形成固定化载体，再利用固定化载体特异性吸附重组酶形成固定化酶。最后，单因素优化实验确定固定化酶的催化反应条件，在30 ℃、pH 8.0的条件下，以60 mmol/L胞苷和0.5 mmol/L ATP为底物，可实现5批次的高效连续催化反应，胞苷酸平均摩尔得率达到91.2%。上述制备方法反应成本低，产物得率高，酶利用率高，在工业生产中具有较好的应用潜力。     

MRI对卵巢成熟畸胎瘤术前诊断初步探讨

目的:探讨MRI对卵巢成熟畸胎瘤术前诊断价值及手术方式选择的指导意义.方法:回顾性分析经妇科手术治疗、病理诊断为卵巢成熟畸胎瘤58例,术前均行MRI扫描.采用自旋回波(SE)序列、快速自旋回波(FSE)序列、压脂序列、DWI序列扫描.常规行矢状面、横断面及冠状面扫描.结果:(1)病变位于右侧卵巢30例,左侧卵巢28例,双侧卵巢3例.(2)病变大小为1.2-16.7cm,边缘较清晰,形态多为类圆形.(3)病变为囊性或囊实性.其内成分多样,MRI信号显示混杂,脂肪成分MRI上T1W、T2W为双高信号,脂肪抑制序列为低信号;牙齿、毛发、软骨、纤维成分T1W、T2W为双低信号;肌肉、神经成分T1W、T2W为等信号.(4)病变小于10 cm,其内脂肪成分较多,无腹腔镜手术禁忌症患者行腹腔镜卵巢畸胎瘤切除术;病变大于10 cm,钙化、毛发等实性成分较少时,能耐受膀胱截石位,行阴式卵巢畸胎瘤切除术;病变大于15 cm,或病变较小但以钙化、牙齿、毛发等实行性成分为主,怀疑恶性卵巢畸胎瘤或者不能判断病变性质时行传统方式开腹卵巢畸胎瘤切除术.结论:MRI能较好显示卵巢畸胎瘤内部结构及成分,在临床手术术式选择方面具有指导意义.     

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。     

急性脑梗死患者并发医院肺部感染的影响因素分析

目的:探讨急性脑梗死患者并发医院肺部感染的相关影响因素,为临床的预防与治疗提供指导依据。方法:回顾性分析我院神经科2011年1月~2013年8月收治入院的526例急性脑梗死患者的临床资料。结果:在全部526例急性脑梗死患者中,并发医院肺部感染的有79人,占15.0%。分析显示,高龄、吸烟史、糖尿病、意识障碍、吞咽困难、低蛋白血症等原因是并发肺部感染的危险因素。而从这些感染者的痰液中共分离出病原菌98株,包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、白假丝酵母菌等。结论:急性脑梗死患者易并发医院肺部感染,其危险因素主要有高龄、吸烟史、糖尿病、意识障碍、吞咽困难、低蛋白血症等。     

特定营养物对L-谷氨酸发酵的影响及优化

目的：以黄色短杆菌GDK-9为供试菌株,分析柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂等特定营养物的添加对L-谷氨酸发酵的影响,并对其发酵条件进行优化研究。方法：在单因子实验确定添加时间的基础上,应用SAS软件中的响应面分析方法（RSM）对柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂等3个因素的添加量进行优化;采用多元二次回归方程拟合3种因素与L-谷氨酸产量的函数关系,并得到其最适添加量。结果与结论：当柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂的添加量分别为0.355%、0.297%和0.183%时,10L自控罐发酵产谷氨酸达到140g/L,比优化前（128g/L）提高了9.38%。     

柠檬酸钠对L-组氨酸发酵代谢流分布的影响

目的：建立谷氨酸棒杆菌TL1105生物合成L-组氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析。方法：通过所构建的L-组氨酸代谢网络模型,利用MATLAB软件计算出添加柠檬酸钠和不添加柠檬酸钠发酵中后期代谢网络的代谢流分布。结果：在L-组氨酸分批发酵过程中,在发酵初期未添加柠檬酸钠的条件下流向戊糖磷酸途径（HMP）的代谢流为9.59,合成组氨酸的代谢流为8.91;在发酵初期添加2g/L柠檬酸钠的条件下流向HMP的代谢流为12.74,合成组氨酸的代谢流为9.61。结论：在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A的代谢流分布,保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP之间代谢流量平衡,有利于提高L-组氨酸生物合成途径的代谢流量,最终使流向组氨酸的代谢流增加了7.86%。