猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一[1],可引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,还可引起仔猪的皮炎和腹泻.PPV在我国污染非常严重,部分地区阳性率达90%以上[2].PPV能在大多数哺乳动物传代细胞系内长期潜伏感染,而且量少时不易检出,当细胞连续传代时可能引起细胞病变至细胞死亡,有可能给实验室带来较多麻烦.VP2蛋白是该病毒的主要结构蛋白之一,本研究构建含VP2蛋白的主要抗原表位基因的真核表达载体并获得其稳定表达的细胞株.     

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染

根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.     

伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白的胞内定位研究

根据GenBank已发表的PrV ul24基因序列(NC006151),设计并合成一对引物,PCR扩增出ul24基因编码区,克隆于pEGFP-N1载体,得到重组质粒pUL24-GFP.酶切鉴定,测序及Western Blot验证重组质粒.ul24基因序列测定结果已提交GenBank,登录号DQ226544.Western blot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD.将pUL24-GFP转染真核细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位,结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核.     

热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果

为了初步探索热休克蛋白70(Hsp70)作为分子佐剂增强猪瘟病毒亚单位疫苗的免疫效果,本研究根据猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0的基因序列,设计一对特异性引物,RT-PCR扩增得到完整的E0基因,将其分别插入到原核表达质粒pColdI和含有副猪嗜血杆菌Hsp70的pColdI-Hsp70中,构建了pColdI-E0和pColdI-E0-Hsp70重组质粒,经IPTG诱导表达后,获得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白。将以上三种蛋白纯化后分组免疫Balb/c小鼠,通过ELISA和流式细胞术测定了小鼠针对E0蛋白的体液免疫和细胞免疫效果。结果显示:E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能显著提高抗E0的抗体效价、CD4+和CD8+T细胞水平,并促进IFN-γ的释放。研究结果表明Hsp70能显著增强猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0在小鼠上的免疫效果,为在猪体上的进一步应用奠定了基础。     

丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG)),PCR产物连接到pMDl8-T克隆载体后亚克隆到表达载体pET-22b(+),转化到表达宿主大肠杆菌BL2l(DE3).重组大肠杆菌经IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原(pro-TG)主要以可溶性蛋白表达.菌体离心后用丙酮高速搅拌破碎细胞,亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原.转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后其酶活为502.8 U/g CDM(菌体干重).采用BSA交联试验证实成熟的转谷氨酰胺酶(TG)具有功能.采用丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原对大规模工业化生产转谷氨酰胺酶进行了有益的探索.     

柳珊瑚共附生放线菌Streptomyces sp. SCSGAA0009中生物碱类化合物及其抗菌和抗附着活性

【目的】从南海柳珊瑚共附生放线菌的次生代谢产物中寻找具有抗菌和抗附着活性的先导化合物。【方法】应用化学与生物活性相结合的筛选方法,从柳珊瑚共附生微生物中筛选获得代谢产物丰富且具有生物活性的目标菌株并通过大发酵提取浸膏,利用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和高效液相色谱等方法对发酵产物进行分离、纯化,运用波谱解析鉴定化合物的结构。【结果】从采自海南三亚的柳珊瑚(Muricella flexuosa)样品中分离到一株放线菌SCSGAA0009,鉴定为链霉属Streptomycessp.,从其改良ISP2发酵液中分离到新化合物N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)propionamide(1)和已知化合物phenazine-1-carboxylic acid(2),其中化合物2对大肠杆菌和海洋细菌假单胞菌(Pseudoaltermonas piscida)具有较好抗菌活性,且有强抗草苔虫(Bugulaneritina)幼虫附着活性。【结论】首次从柳珊瑚共附生放线菌的次生代谢产物中获得新的生物碱化合物1,首次报道化合物2的抗海洋细菌活性和抗附着活性;从南海柳珊瑚共附生微生物的次生代谢产物中可以得到新化合物和活性化合物,这一来源的微生物资源值得深入研究。     

雅鲁藏布江流域NDVI变化与风沙化土地演变的耦合关系

运用1982-2010年的两种NDVI数据集（Pathfinder AVHRR和SPOT VEGETATION）,以及1975、1990、2000和2008年4期遥感数据,通过GIS技术、人工目视解译和灰色关联分析方法,研究了雅鲁藏布江流域NDVI变化和风沙化土地演变的耦合关系,结合1957-2007年降水和气温逐日气象资料,探讨了气候变化对其耦合关系的影响。结果表明：（1）流域内1982-2010年NDVI的年际变化总体上呈波动式增长的趋势。NDVI空间分布呈现由下游向中上游逐渐降低的趋势,以米林宽谷最大、马泉河宽谷最小。（2）2008年流域内共有风沙化土地273 697.54hm²,呈现由江源区马泉河宽谷向中下游递减的趋势。1975-2008年流域内风沙化土地呈缓慢增长趋势,以1990-1999年增长率最高,2000-2008年的增长率最小。（3）对于NDVI年变化和植被生长季（7-9月份）的变化,马泉河宽谷受平均气温的影响最大,日喀则宽谷和山南宽谷受年降水量的影响最大;米林宽谷NDVI的年变化受风沙化土地扩展的影响最大,植被生长季变化受年降水量的影响最大。（4）不同宽谷段NDVI与风沙化土地年变化的关联度自下游向中上游呈总体减小的趋势。流域尺度NDVI植被生长季变化主要受平均气温和年降水量的影响,非植被生长季（10月-翌年6月）变化主要受风沙化土地扩展的影响。     

伊犁河谷春秋草场草地生态调查及其恢复对策

针对新疆伊犁河谷春秋草场严重退化的现状,通过对退化草场、围栏封育并实施灌溉的草场、单纯围栏的草场和灌溉但不封牧草场样方的对比调查,从地表植物的生物量、植物种类、优质牧草所占比例和草地植物多样性指数等的变化规律和特征方面,探讨了伊犁河谷地区春秋草场退化的原因和恢复措施。结果表明:适当灌溉后草地生物量为1540.5g.m-2,远高于不灌溉的草地(生物量为188.13g.m-2),表明干旱是本区草地植被生长一个重要制约因素;而仅改变草地的水分条件,在超载率达123%的大环境下,草场中优质牧草的比例由封育的62.38%下降到未封育的2.08%。因此,适度放牧并辅以灌溉措施是本区天然草场恢复的2个必要条件。     

海洋真菌Aspergillus sp.SCSGAF 0076与细菌Bacillus sp.MNMCCE001共培养次生代谢产物

【目的】阐明海洋真菌Aspergillus sp.SCSGAF 0076与细菌Bacillus sp.MNMCCE 001在平板上共培养时产生的主要抗菌物质和红色素的化学结构。【方法】在固体淀粉培养基上分别进行Aspergillus sp.SCSGAF 0076纯培养、以及SCSGAF 0076和Bacillus sp.MNMCCE 001共培养,培养3 d后分别对纯培养和共培养的培养基进行萃取浓缩得到浸膏,运用高效液相色谱分析比较纯培养和共培养所得浸膏的化学分成的差异,并采用抗菌活性追踪法,结合硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相色谱等分离方法从共培养浸膏中分离纯化抗菌物质和红色素,运用波谱解析法鉴定化合物的结构。【结果】通过高效液相色谱分析发现,共培养与纯培养的主要次生代谢产物没明显差异,但抗菌物质和红色素的含量差别明显。从这两株菌共培养的发酵产物中分离鉴定了4个化合物,包括抗菌物质青霉酸(1)、青霉酸类似物5(6)-dihydropenicillic acid(2)和9-chloro-8-hydroxy-8,9-deoxyasperlactone(3)、以及红色素viopurpurin(4)。【结论】初步阐明了Aspergillus sp.SCSGAF 0076与Bacillus sp.MNMCCE 001共培养时由Aspergillus sp.SCSGAF 0076产生的主要抗菌活性化合物是青霉酸,伴随明显增多的主要红色素是viopurpurin,二者产率均比Aspergillus sp.SCSGAF 0076纯培养时高。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。