大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产L-瓜氨酸条件优化

实现了精氨酸脱亚胺酶(ADI)首次在钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA 5-5中的高效表达。通过Ni-NTA亲和层析纯化得到纯化ADI,经SDS-PAGE测定其分子量约为46.8 k Da,酶学性质研究发现ADI的最适催化温度为37℃,最适pH为6.5,ADI在最佳催化条件下作用于L-精氨酸的米氏常数为12.18 mmol/L,最大反应速率为0.36μmol/(min·mL)。优化了重组菌全细胞转化产L-瓜氨酸的工艺条件,在最优条件下可一次转化300 g/L L-精氨酸,转化速率达8 g/(L·h)。进行重组菌5 L罐发酵并进行罐上全细胞转化300 g/L L-精氨酸,一批菌体可进行多次转化,累计产量达1 900 g以上。     

合成生物学与代谢工程在谷氨酸棒杆菌产氨基酸中的应用

氨基酸是重要的化合物,在食品、医药、化工等领域具有广泛用途.多种氨基酸可以通过蛋白质水解提取法、化学合成法以及微生物法生产,现如今大部分的氨基酸都开始尝试微生物发酵法实现工业生产.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为发酵生产氨基酸的先驱者,其生产的氨基酸产量已达年产数百万吨.随着合成生物学技术以及新一代基因编辑技术的兴起,谷氨酸棒杆菌能生产的氨基酸种类从传统的几种氨基酸扩大到了几乎所有氨基酸及其衍生物.本文综述了近年来利用代谢工程及合成生物学工具对谷氨酸棒杆菌的改造技术,并介绍了一些利用谷氨酸棒杆菌生产传统氨基酸以及非天然氨基酸的典型案例,为谷氨酸棒杆菌突破所有氨基酸生产瓶颈提供参考.     

表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。     

外源亚精胺对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响

以高感白粉病甜瓜‘066’、感病品种‘0544’、抗病品种‘Yuntian-930’为试材,对白粉病菌胁迫下外源亚精胺（Spd）处理的甜瓜幼苗叶片超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）活性,以及过氧化氢（H₂O₂）、丙二醛（ MDA）和光合色素含量进行了研究,探讨外源Spd对甜瓜白粉病抗性的诱导效应及其生理机制。结果表明：（1）白粉病菌接种后甜瓜叶片的防御酶活性、光合色素含量先升后降,MDA含量升高;（2）外源Spd处理缓解了白粉病菌胁迫下甜瓜叶片防御酶活性、光合色素含量的下降,降低MDA含量及甜瓜的病情指数,并以1.0 mmol/L Spd处理效果最佳;（3）外源Spd处理使甜瓜叶片产生了更多的H₂O₂;（4）外源Spd提高甜瓜对白粉病抗性具有一定广谱性,且可向上传导。研究认为,H₂O₂可能参与白粉病胁迫下信号的传递,外源Spd可通过缓解白粉病菌胁迫下甜瓜防御酶活性和光合色素含量的下降来诱导甜瓜对白粉病的抗性。     

谷氨酸棒杆菌anti-σ因子CseE及其突变体与σ因子SigE的相互作用分析

[目的]谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对SigE与ZAS家族蛋白CseE相互作用机制进行探索研究,重点分析CseE突变体影响与SigE结合能力的机制。[方法]本研究选择谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的SigE和CseE蛋白为研究目标,利用遗传学方法获得过表达的重组谷氨酸棒杆菌,通过RT-qPCR研究SigE调控sigE和cseE的转录情况。同时,利用ITC和His pull-down实验验证ZAS家族的CseE蛋白与Zn²⁺及SigE的结合情况。之后对CseE蛋白进行功能域分析、多序列比对,研究功能域关键氨基酸位点对SigE结合能力的影响。其次对SigE和CseE蛋白进行分子对接和动力学模拟,分析关键氨基酸影响其结合的机制。[结果]谷氨酸棒杆菌SigE调控基因sigE和cseE的转录并且其活性受CseE蛋白控制。CseE蛋白为ZAS家族蛋白,具有Zn²⁺结合能力。CseE_His83A、CseE_cys87A和CseE_cys90A突变体不会影响与SigE的结合能力,而CseE_C87A-C90A和CseE_{His83A-C87A-C90A}突变体与SigE的结合能力略有下降。分子动力学模拟发现SigE-CseE_C87A-C90A和SigE-CseE_{His83A-C87A-C90A}之间的结合能量为-17.23 kcal/mol和-14.06 kcal/mol,分别比未突变体系结合能量降低22.8%及36.9%。[结论]谷氨酸棒杆菌SigE通过聚集RNA聚合酶来调控基因sigE和cseE的表达。CseE蛋白属于ZAS家族,具有Zn²⁺结合能力同时通过与SigE蛋白互作来抑制SigE活性。CseE_C87A-C90A及CseE_{His83A-C87A-C90A}突变体能影响与SigE结合的能力,减弱对SigE活性的控制。本研究产生的三维结构和确定的氨基酸关键位点为后续探索谷氨酸棒杆菌SigE和CseE响应环境压力机制提供了理论基础。     

1-MCP对东方百合开放与衰老的影响

以东方系列百合（Lilium spp.）‘西伯利亚’品种为材料,研究了1-甲基环丙烯（1-MCP）对百合切花质膜透性、乙烯释放量、丙二醛含量、可溶性蛋白质含量等生理指标的影响。结果表明：1-MCP可延缓百合切花花瓣质膜相对透性的增加,延长百合切花瓶插寿命;降低百合花瓣乙烯释放量,推迟乙烯峰的出现;降低百合花瓣丙二醛含量,对可溶性蛋白含量的变化无明显影响。本研究结果说明1-MCP对东方百合切花的保鲜有一定效果,确定了1-MCP处理东方百合的最佳使用浓度为0.01μL/L。     

黄瓜分子标记辅助育种研究进展

本文综述了不同分子标记技术在黄瓜遗传连锁图谱构建、重要性状相关基因的定位、种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定、分子标记辅助选择、种子纯度与活力鉴定及其在黄瓜遗传育种等方面的应用,讨论了目前黄瓜遗传育种中应用分子标记技术存在的问题和今后育种工作的重点,并对黄瓜分子标记辅助育种的前景作了展望。     

β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶共表达一步法催化乳糖到塔格糖

[目的] 构建一株以廉价原料乳糖为底物合成塔格糖的重组菌株,实现一步法高效生物合成稀有糖——塔格糖。[方法] 从Escherichia coli K-12基因组中,PCR扩增出阿拉伯糖异构酶araA和β-半乳糖苷酶lacZ基因,以SD-AS为连接子,利用pET28a-1载体串联表达于Escherichia coli BL21（DE3）,获得重组菌E.coli BL21/pET28a-araA-lacZ,对重组菌全细胞催化合成塔格糖的条件进行了工艺优化与放大研究。[结果] araA和lacZ基因在E.coli BL21中同时高效表达,在最优条件（pH 8.0、温度50℃、5 mmol/L Mn²⁺、添加0.5 mol/L硼酸和0.1% SDS）下,E.coli BL21/pET28a-araA-lacZ全细胞转化100 g/L乳糖,合成塔格糖最高产量达24.03±2.03 g/L,乳糖到塔格糖的摩尔转化率为45.67%,随着底物乳糖浓度的提高,塔格糖产量呈不同程度的提高,当投加500 g/L底物乳糖时,全细胞合成塔格糖产量最高达83.81±1.38 g/L。[结论] 通过2个关键靶酶的编码基因araA和lacZ在E.coli BL21细胞中进行共表达,实现了以重组菌全细胞为催化剂转化廉价底物乳糖,一步法高效合成稀有糖塔格糖,该研究为生物法制备低能量的功能性稀有糖奠定了较好的研究基础。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酸

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力。最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了5 L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68) g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32) g/L提高了41.2%;糖酸转化率为55.8%,较原始菌的44.2%提高了11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。