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真核生物多头绒泡菌的原质团是研究细胞周期的好材料。但尚无合适的表达体系可供选择。本研究用多头绒泡菌ardC actin基因启动子和终止子分别替换哺乳动物细胞表达质粒pDsRed1-N1的CMVIE和SV40 polyA片段,构建了多头绒泡菌红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pXM1;用PardC-MCS-DsRed1-TardC替换pTB38表达盒PardC-hph-TardC,构建了多头绒泡菌RFP表达质粒pXM2。将多头绒泡菌转录延伸因子类似蛋白(PELF1)基因与质粒pXM2重组,构建了PELF1红色荧光融合蛋白(PELF1-RFP)表达质粒pXM2-pelf1。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察RFP表达发现,电转参数为4kV/cm(电场)、1A(电流)、70μs(电击时间)时,质粒pXM1和pXM2电转多头绒泡菌微原质团(≤500μm)后24~48h内,RFP荧光最显著;而PELF1-RFP则主要聚集在多头绒泡菌细胞核,说明本试验建立的表达系统可以用于研究特定蛋白在多头绒泡菌内的瞬时表达。 相似文献
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SR蛋白激酶(serine/arginine protein-specific kinase,SRPK)是一类特异磷酸化剪接因子SR蛋白的激酶家族,可调节SR蛋白的选择型剪接,影响SR蛋白在核内的分布与定位,在pre-mRNA剪接调控上具有重要的作用。目前对于多头绒泡菌SRPK的功能仍不清楚。为了进一步研究PSRPK的功能,设计可转录小干扰RNA(siRNA)的寡核苷酸序列含U6启动子的载体pSIREN-RetroQ定向连接,构建了真核表达质粒pSIREN-PSRPK-1,pSIREN-PSRPK-2,pSIREN-PSRPK-3,pSIREN-PSRPK-4,pSIREN-PSRPK-5及对照质粒pSIREN-PSRPK-Neg。把编码PSRPK基因的cDNA与红色荧光蛋白表达载体pDsRed-N1重组,构建了表达PSRPK-红色荧光融合蛋白的表达质粒pP-SRPK-DsRed。将真核表达质粒和质粒pPSRPK-DsRed共转染HEK293细胞。转染后72h通过倒置荧光显微镜观察,结果表明,pSIREN-PSRPK-2和pSIREN-PSRPK-5可以有效沉默红色荧光融合蛋白的表达;进一步采用RT-PCR和Northern点杂交分析表明,pSIREN-PSRPK-2和pSIREN-PSRPK-5对红色荧光融合蛋白mRNA表达具有明显的抑制作用与倒置荧光显微镜下观察到的结果一致。这为进一步研究多头绒泡菌SRPK的功能奠定了实验基础。 相似文献
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经抗SC35单克隆抗体标记后,在电子显微镜下观察到多头绒泡菌S、G2、前期、中期和后末期细胞核中存在大量金颗粒,说明多头绒泡菌细胞核含有SC35类蛋白。在G2期和前期时,SC35类蛋白主要分布在细胞核的核仁区域和非核仁区域的染色质间区域;中期和后-末期时,SC35类蛋白主要分布在细胞核内染色体间区域;说明染色质(体)间区域和核仁区域是富含SC35类蛋白的区域。对核仁的进一步观察指出,在核仁中金颗粒主要分布在DFC,FC中的金颗粒很少,说明在核仁中SC35类蛋白主要存在于DFC组分中。 相似文献
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蚕豆染色体周边RNP形成过程的电镜研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文运用Bernhard染色方法研究了蚕豆根端分生组织细胞中染色体周边RNP的超微结构以及这种周边RNP在有丝分裂前期到中期的形成过程。我们观察到,在前期核仁解体过程中,来自核仁的RNP物质结合于染色体表面,形成染色体周边RNP。前期末时,大量核仁RNP颗粒向周围扩散并进一步结合于染色体表面,使染色体周边RNP有所增加。中期染色体的周边RNP明显多于前期,由直径15-20 nm的RNP颗粒构成。RNP物质在染色体周边的分布是不均匀的。姊妹染色单体之间往往有较多的RNP物质存在。本文观察结果表明染色体周边RNP来源于核仁RNP。 相似文献
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通过“供体──受体”原生质体融合获得5个“波缘烟草+普通烟草”体细胞杂种细胞系(TU_1至TU_5)。对5个杂种细胞系的细胞学观察表明,其中2个系为多细胞融合产物,其平均染色体数目分别为167.2和198.4;3个系为二细胞融合产物,其平均染色体数目分别为54.370.6和62.8。杂种细胞系的一个明显特征是所有观察的中期细胞均存在数量不等的畸变染色体。对5个杂种细胞系再生植株叶片苹果酸脱氢酶和酯酶的同工酶分析结果表明,它们均为程度不同的不对称核杂种,即只含有供体亲本(波缘烟草)的部分核基因组。以小麦rDNA为探针对杂种细胞系基因组DNA的Southern杂交结果表明,杂种中双亲的载有rDNA的染色体可能均有部分消除;此外,杂种中新DNA片段的存在说明双亲rDNA可能发生了分子间重组。两个由多细胞融合产生的杂种细胞系(TU_2和TU_5)再生苗不易生根而且形态上异常。3个由二细胞融合产生的杂种细胞系(TU_1、TU_3和TU_4)再生苗可生根长大,形态上类似受体亲本;对其根尖的细胞学观察表明,染色体数目在51─66之间,说明均为只含有少量供体亲本染色体的不对称核杂种。 相似文献
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本文报道了有丝分裂过程中蚕豆(Vicia faba)根端分生组织细胞内一种由核仁物质组成的特殊结构,我们将其称作核仁残体。经常规染色后,可在前期末正在分散的核仁物质中看到由直径15—20nm 的颗粒和纤维组成的核仁残体;前中期时,核仁残体附着在染色体上,其电子密度低于染色体。Bernhard 染色结果表明,核仁残体的主要成分是核糖核蛋白(RNP)颗粒和纤维,一些核仁残体中存在着与染色质染色反应相似的被漂白区。有的核仁残体附着在中、后期染色体上,有的游离存在于细胞质中。本文讨论了核仁残体的成分及其本质等问题。 相似文献
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许多植物细胞核中存在一些较小的球形或卵圆形的结构,不同作者分别将其称为球体(spherules)[1]、核体(karyosome)[2]、核仁附着小体(nucleolusasociatedbodies)[3]、螺旋小体(coiledbodies)[4... 相似文献
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里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达 总被引:9,自引:0,他引:9
进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2.11U/mL。 相似文献
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粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性 总被引:9,自引:2,他引:9
粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)是粉尘螨Dermatophagoides farinae主要变应原,可引发Ⅰ 型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出Der fⅠ 片段,产物连接入T载体(pMD18)。经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET24a表达载体上,得到重组质粒pET24a-Der fⅠ,工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出Der fⅠ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用Western blot及ELISA方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献