中药金汁和粪菌移植液的菌群结构特征

摘要：目的 明确中药金汁的菌群结构和数量,阐明金汁和粪菌移植液的菌群差异。方法 课题组在福建省泉州市花桥慈济宫采集了金汁样本9份,在宁夏标准粪菌移植库制备粪菌移植液9份。采用宏基因组学16S rRNA技术对9份金汁和9份粪菌移植液样本的菌群进行检测。结果 金汁和粪菌移植液在门、纲、目、科、属和种等不同生物学等级进行对照研究,发现丰富度差异较大的10个菌属,金汁中的变形菌从门、纲、目、属和种等不同层级的丰富度均高于粪菌移植液(t=2.647 1,P=0.003 2)。金汁中的厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门的丰富度明显低于粪菌移植液（t=2.824 9、2.782 1、3.684 5、2.735 4,均P<0.01,）。结论 中医金汁的菌群生物学特征明显不同于现代的粪菌移植液。     

2种气管黏膜上皮细胞体外培养技术的研究

目的为以猪气管黏膜上皮为细胞模型的研究奠定物质基础,进一步探讨猪气管黏膜上皮细胞的体外传统培养和气液界面培养技术,从而使2种培养技术优势互补。方法对猪气管上皮分离、纯化、培养和传代,并探索上皮细胞最佳冻存复苏条件;复苏后的气管上皮细胞进行气液界面培养,绘制细胞生长曲线和观察细胞纤毛生发情况。利用免疫组化法鉴定上皮细胞。结果4步纯化法可以得到高纯度的气管上皮细胞。使用胎牛血清、DMEM/F12培养液和DMSO的体积分数为50%、40%和10%的冻存体系保存的气管上皮,复苏后细胞存活率平均可达89%。优化后的传统方式培养的上皮细胞可连续传代到第8代,但从第2代开始便观察不到纤毛,转换成气液界面连续培养2代后重新生发纤毛,细胞存活期延长。免疫组化结果显示分离培养细胞为上皮细胞。结论成功建立了2种猪气管上皮细胞培养技术,并找到适宜的气管上皮细胞冻存条件,节省了不断原代取材的成本和时间,并成功实现传统培养细胞冻存复苏后很快适应气液界面的培养并恢复细胞的天然结构,为猪气管黏膜上皮相关研究提供丰富的细胞来源。     

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C-株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK-6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT-PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定.结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性.猪瘟病毒C-株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具.     

小牛胸腺新胸腺活性因子(TAF-Ⅰ)的纯化和鉴定

以小牛胸腺为原料 ,通过匀浆、冻融、超滤、SephadexG 15凝胶过滤、DEAE SephadexA 2 5阴离子交换层析和反相高效液相色谱等步骤 ,分离得到了胸腺活性因子Ⅰ (thymusactivityfactorⅠ ,TAF Ⅰ ) .5 0 0g小牛胸腺组织中纯化得到了 0 92mg胸腺活性因子Ⅰ .经ESI MS质谱鉴定 ,结果显示其分子量为 6 18 8.氨基酸组成分析显示它由Ala、Gly、Glu、Gln、Lys、Ser 6种氨基酸残基组成 .体外生物学活性实验证明 ,TAF Ⅰ能显著促进人外周血淋巴细胞的E 玫瑰花结的形成率和促进小鼠脾淋巴细胞的分裂增殖     

表达轮状病毒G2和G3型vp7基因重组腺病毒的免疫效果

为探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价轮病毒(Rotavirus,RV)基因工程疫苗的可行性,在前期工作的基础上,对表达我国G2和G3型毒株νp7基因的重组腺病毒的免疫效果进行了研究.分别用表达G2和G3型的νp7基因的重组腺病毒rvAdG2vp7、rvAdG3VP7经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体、黏膜抗体和相关的细胞因子水平进行了检测和比较。结果表明,用表达G2和G3型νp7基因的管理费用腺病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠后,可诱导机体产生较强的RV特异性免疫反应,名手体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,并能产生中的抗体.但免疫反应以Th1类反应也占有相当的比例.本研究为新型RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因DNA疫苗的构建及动物免疫试验

丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus,HCV）主要通过输血传播,可以导致多种临床型的肝炎及其它肝脏疾病,包括肝硬化及肝细胞癌。目前尚无一种有效的抗HCV的措施,这使人们把眼光放到该病的预防上,DNA疫苗的产生为研制丙型肝炎（丙肝）的预防及治疗性疫苗提供了新的思路。基因免疫是近几年快速发展起来的一种新型方法,它是将带有目的蛋白的编码基因和表达调控序列的质粒DNA导入机体组织后,使目的基因在体内表达,并全方位的刺激机体的免疫系统,     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT－PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL)一中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒E2基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组质粒pPROEX-GXYL和pPROEX-C,经PCR,酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置,大小和读码框均正确。SDS－PAGE,检测表明,经重组质业pPROEX-GXYL和pPROEX-C转化,诱导的受体菌能表达E2基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有髙免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况。SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变。21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性。