牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达

以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAc,转化大肠杆菌JMl05,对数生长期加入O．1mmo1／L IPTG能明显诱导凝乳酶原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低j在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12～19％,按ELISA法测定凝乳酶原产量为80～100mg／L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。     

Mechanism of enhancement of prochymosin renaturation by solubilization of inclusion bodies at alkaline pH

The renaturation efficiency of recombinant prochymosin depends on not only the renaturation condi-tions but also the solubilization (denaturation) conditions. Compared with pH 8, solubilization of prochymosin-contain-ing inclusion bodies at pH 11 (8 mol/L urea) results in onefold increase of renaturation efficiency ( ~ 40% vs. ~ 20 % ). Alkaline pH facilitates the solubilization of inclusion bodies via the breakage of intermolecular disulfide bonds. Moreover, alkaline pH renders prochymosin molecules to be in a more reduced and more unfolded state which undergoes refolding readily.     

具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌AS1．881固定化细胞

1．大肠杆菌Asl．881是一株天门冬氨酸酶的高产菌株,每毫升培养物为2000单位左右,约相当于每克湿细胞10万单位。 2．比较了琼脂凝腔包埋法和聚丙烯酰胺凝肢包埋法两种制备固定化细胞的方法,前者较后者有较大的优越性：收率高,无毒,成本低,方法简便. 3．比较了固定化细胞和自然细胞天门冬氨酸酶的一些生物化学性质：pH、温度和二价金属离子对两者酶促反应速度的影响相似;固定化细胞热稳定性较差,但Mn2+,Mg2+,Ca2+,Fc2+等二价金属离子对热钝化有保护作用;在底物和pH6.5柠檬酸缓冲液中于37℃保温,两种细胞的酶活力均有显著提高。 4．固定化细胞柱可被用于连续生产L一天门冬氨酸,包埋80克湿细胞的固定化细胞柱在37℃连续工作20天,可催化约1000升1M反丁烯二酸铵完全转化为L-天门冬氨酸,并保存其大部分酶活力。