pH对毕赤酵母表达重组人复合a干扰素的降解影响

使用Pichia pastoris表达重组人复合a干扰素(cIFN)会发生降解、聚合等不均一表达的现象。在5 L发酵罐中考察了不同诱导pH对cIFN表达产生降解的影响, 结果发现在适合酵母生长的pH 3.0~7.0范围内, 当诱导pH为4.0~5.0时, cIFN不均一表达现象最少, 生物活性达到2.5×108 IU/mL。通过测定发酵液中总蛋白酶活和细胞活性寻找了cIFN降解出现的原因：发现低诱导pH下细胞死亡率升高释放更多酶系, 高诱导pH下蛋白酶活性明显增大, 两者都使蛋白酶作用加强, 加剧cIFN的降解; 特别是诱导pH为7.0时, 适宜的pH使蛋白酶酶活陡升, 将cIFN完全降解。     

一种新的在线细胞显微观察仪及其在生化反应器上的应用研究

针对生化反应器应用条件,提出了用于生化反应器的在线细胞观察仪的基本技术要求。在比较了国内外现有的细胞在线显微工作原理后,研制了一种基于暗视场的新的显微细胞观察仪,介绍了其关键技术及结构。另外,原位在线显微细胞观察仪应用于酿酒酵母和哺乳动物细胞HEK293细胞的培养试验,在线细胞计数结果与离线细胞计数和细胞干重相比较,均有很好的相关性,表明此仪器基本满足使用要求。     

基于易错PCR技术的红酵母D-氨基酸氧化酶的定向进化

采用易错PCR技术对来源于红酵母Rhodotorula gracilis的D-氨基酸氧化酶基因(RgDAAO)进行突变,构建并优化了突变株文库;结合48深孔板的高通量筛选方法,获得突变株M3217,其V_(max)相对于野生型提高了16.8%。对测序结果进行分析,发现突变酶基因序列中有5处点突变,其中3处发生了氨基酸置换,分别为:D242V/Q253R/D304V。利用Swiss-Model对突变株M3217进行三维结构模拟,结果显示所有突变位点都不在催化活性中心的附近,特别是V304的位置在连接F5和F6两个β折叠股的长loop环上。推测D304V这一突变位点很可能增强了RgDAAO二聚体形态的稳定性,或是增强了与辅酶FAD的结合能力,从而间接提高了全酶的催化活力。     

肌苷合成关键酶活性与肌苷积累之间的关系

测定比较了高产肌苷菌、低产肌苷菌和野生菌肌苷合成途径中PRPP转酰胺酶、sAMP合成酶、IMP脱氢酶和5′核苷酸酶的比活以及活细胞的肌苷水解能力,进一步阐明了菌株产苷性能与肌苷合成途径关键酶活力间的密切关系。根据高产肌苷菌的酶学特性,确定了高产肌苷菌进一步基因工程改造的方向。研究表明酶学研究对有目的、有方向地进行高产菌株的选育工作具有重要意义。     

基于过程参数相关分析的鸟苷发酵过程优化

本文分析鸟苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)在50L多参数自控发酵罐上的发酵过程特点,基于多种在线及离线参数的检测,通过相关分析将生理调控的工艺参数和生物合成过程中的代谢流分布相联系,发现了发酵过程中的代谢流向糖酵解和TCA循环的迁移,并初步分析了产生代谢流迁移的原因,在此基础上优化发酵过程使产苷水平稳定在30g/L。     

同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累

利用重组毕赤酵母(Richia pastoris)强化表达S-腺苷甲硫氨酸(S-adenvylmethionine,SAM)合成酶(SAM synthetase,SAMS),发酵生产SAM时,胞内SAMS活性和ATP水平是影响SAM合成的重要因素.为了同时保持较高的SAMS活性和ATP供应,我们构建了一株既含有AOX1诱导型表达单元,又含有GAP组成型表达单元的双SAMS表达单元P.pastoris重组菌株Gd.它既能受甲醇调控表达SAMS,又能以甘油为碳源表达SAMS.在培养过程中,先是以甲醇诱导SAMS表达,得到较高的酶活,然后在发酵中后期再将碳源换为甘油.这样不但可以维持较高的酶活,而且可以提高胞内ATP含量.实验结果显示,对于同时利用AOX1和GAP启动子表达SAMS的重组菌,可采取甲醇和甘油两阶段补料,该重组菌的SAMS比产率高于组成型重组茵Xg,Gd进入甘油补料期后胞内ATP含量高于诱导型重组菌Ga.双表达单元菌株Gd的SAM产量达到1.41 g/L,比诱导型表达SAMS的重组菌株提高了76.3%,比组成型表达SAMS的重组菌株提高了60.2%,.     

生物反应器及其研究技术进展

阐述了生物反应器设计、放大的新理念及关键技术发展,并在此基础上综述了应用于生物技术产品生产的生物反应器的主要发展趋势,包括以代谢流分析为核心的生物反应器系统、基于计算流体力学模拟技术的传统发酵罐改良、微型生物反应器、动物细胞反应器和酶反应器。     

合成生物学之我见

<正>"专家视点"是刊物新设栏目。希望能与读者分享生物技术领域热点问题的专家见解,开阔视野,为生物技术领域的研发和产业化发展提供重要参考信息。本期我们特别刊登了华东理工大学张嗣良教授对合成生物学发展的一些看法和观点,以飨读者。同时也希望生物技术领域的其他专家以不同视角和观点进行学科讨论甚至辩论,以求得真理。     

菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系

利用显微图像分析法对顶头孢霉菌的菌丝形态进行了定量研究,并统计分析了头孢菌素C发酵过程中的菌丝形态的变化规律,具体对菌丝长度、菌丝宽度和菌丝生长单位进行了定量分析,分析了菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系。研究表明头孢菌素C的合成是在细长菌丝分化成膨大菌丝片段后才启动的,头孢菌素C可能主要是在膨大菌丝分化成节孢子的过程中被合成。     

用管式光生物反应器培养螺旋藻的研究

微藻大规模培养主要有敞开式大池培养和封闭式光生物反应器培养两种主要方式。管式光生物反应器是封闭式光生物反应器的主要类型之一。与其它类型相比,管式光生物反应器放大较易,成本较低。国外关于管式光生物反应器已有不少研究［１～３］但关于管式光生物反应器产率与光强和光暗比的关系等方面的研究尚未得出明确的结论。国内管式光生物反应器的研究较少［４］,尚未见有关管式光生物反应器中微藻悬浮液流变特性基础参数和产率影响因素的报道。螺旋藻是丝状体蓝藻,螺旋藻蛋白质含量高,其蛋白质所含必需氨基酸丰富,是国内外大规模商业…