重组毕赤酵母表达瑞替普酶(Reteplase)过程中的降解控制

在利用重组毕赤酵母表达瑞替普酶(Reteplase)时,遇到了较为严重的蛋白降解。为了抑制Reteplase的降解,分别研究了pH和氨基酸、蛋白胨等添加物对降解的影响。结果表明,摇瓶培养时用氨水调节pH,并将pH恒定在6.5能有效地抑制降解,这一结果在5L罐上也得到了验证,表达量提高到487mg/L。添加0.1%的Leu或Ala和将蛋白胨用量增加至6%时,Reteplase的降解也能得到有效的控制。     

人肿瘤坏死因子衍生物b cDNA的构建与表达

构建了人肿瘤坏死因子缺失1～7位和102～107位共13个氨基酸编码序列的cDNA,即人肿瘤坏死因子衍生物b(rhTNFαDb),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白量的30%～60％。其中可溶性rhTNFα Db蛋白约占超声上清总蛋白的40%。经柱层析纯化后,目的蛋白纯度达95%以上。以L929细胞株检测rhTNFα Db的细胞毒活性,测得rhTNFα Db的比活性为2×10⁸IU/mg。较rhTNFα 原型提高一个数量级。rhTNFα Db的体内外抑瘤试验也取得了初步结果     

PTHrP受体胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白,Parathyroid hormone related protein)与多种肿瘤的生物学行为有关,尤其对肿瘤的骨转移起重要作用。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常值得研究的课题。从肾癌组织中提取RNA,采用逆转录PCR (RT-PCR)方法获得PTHrP受体N端胞外区543碱基对的带信号肽的cDNA片段。将其核苷酸序列与国外发表的资料相比,基因中第262位核苷酸由T变为C,相应密码子由TAC变为CAC,导致氨基酸变异,即由酪氨酸变为组氨酸。将获得的受体基因克隆到原核表达载体pET-3a,在大肠杆菌得到高效表达,经ELISA证实表达产物可与PTHrP特异性结合。体外生物学活性检测表明表达产物可阻断PTHrP的生物学活性。     

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是：在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDR的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。     

集胞藻Synechocystissp.PCC6803利用葡萄糖生长与光合能量转化的关系

用PAM叶绿素荧光仪测定了饥饿细胞、光自养细胞和混合营养细胞的叶绿素荧光 ,并对 3种类型细胞的荧光参数 :PSⅡ实际光化学效率 φⅡ和还原型质醌Q-A 进行了比较。用双重转盘磷光机测定了光自养细胞和混合营养细胞的毫秒延迟发光。根据叶绿素荧光动力学分析和毫秒延迟发光的结果及光合电子传递抑制剂 3,4_二氯苯基二甲脲 (DCMU)、二溴百里香醌 (DBMIB)对集胞藻 6 80 3(Synechocystissp .PCC 6 80 3)混合营养生长影响进行了分析 ,集胞藻 6 80 3混合营养培养的生长速率显著高于光自养培养的原因可能在于一是外源葡萄糖没有抑制反而是促进了混合营养细胞的光自养生长 ,二是呼吸基质向质醌库提供电子 ,使光合机构的能量转化加强 ,从而促进了集胞藻6 80 3细胞的利用葡萄糖的合成代谢。     

固定化青霉素酰化酶在光-pH敏感可回用两水相中裂解青霉素G为6-APA

两水相体系在发展中存在的关键问题是相体系回收困难.由于生产成本及降低污染的原因, 用过的相体系需要回收和重复使用.用环境敏感型溶解可逆聚合物形成可回用两水相体系是当前是为可行的回收方法。本文在光敏感可回用高聚物PNBC与pH敏感型可回用高聚物PADB形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应。在这个两水相体系中,通过优化,在1% NaCl 存在下,６－ＡＰＡ的分配系数可达5.78。催化动力学显示,达平衡的时间近7h,反应最高得率约85.3%（pH 7.8, 20℃）。较相近条件下的单水相反应得率提高近20%。在反应过程中,通过底物及产物的分配系数检测,发现底物分配系数变化不大,而产物6-APA及苯乙酸的分配系数发生很大变化,从而引起产物的得率变化。在两水相中,底物及产物主要分配在上相,固定化酶分配在下相,底物青霉素G进入下相经酶催化产生的6-APA及苯乙酸又转入上相,从而解除了青霉素酰化酶催化反应的底物及产物抑制作用,达到提高产物得率的效果。此外,采用固定化酶较固定化细胞效率高,占用下相体积小,较游离酶稳定性高,且完全单侧分配在下相。因此,在两水相中进行固定化酶的催化反应具有明显的优越性。形成两水相的高聚物PNBC通过488 nm 的激光照射或经滤光的450nm 光源照射得到回收;pH敏感型成相聚合物PADB可通等电点 4.1沉淀可实现循环利用,高聚物的回收率在95%-98%之间,按此回收率计算,聚合物可使用60次以上。     

豚草叶片和果实气体交换特性与11种土壤重金属相关性

对10个样地中Cu、Pb、Zn、Mn、Cr、Co、Ni、Cd、As、Sb和 Hg 11种土壤重金属含量及样地内豚草叶片和果实气体交换特性进行测定.结果表明,样地内豚草叶片的净光合速率在1.88～9.41 μmol·m^-2·s^-1,而果实的净光合速率最高可达2.81 μmol·m^-2·s^-1.叶片的呼吸速率、气孔导度、光合速率和水分利用效率的平均值分别为1.81 μmol·m^-2·s^-1、75.7 mmol·m^-2·s^-1、6.05 μmol·m^-2·s^-1和4.72 μmol·mmol^-1,分别是果实的5.26、0.64、1.31和1.69倍,说明非同化器官幼嫩果实具有与叶片相当,甚至更强的呼吸、光合能力和水分利用效率;研究地点重金属Ni达到轻微污染水平,其它重金属含量都接近或者显著低于重金属污染的阈值.相关分析和多元回归分析显示,大部分土壤重金属（如Cu、Pb、Zn、Cd、As、Sb和Hg）含量的高低对豚草气体交换特性没有显著影响,仅部分重金属含量与豚草的叶片、果实气体交换特性密切相关,如Ni和Cr对豚草叶片、果实的气孔导度及水分利用效率显著相关;Cr与豚草叶片饱和光合速率显著相关;而As与豚草果实的气孔导度显著相关.表明大部分土壤重金属对叶片和球果的气体交换没有直接影响,而Ni、Cr和As可以在轻微污染甚至没有达到污染水平时影响豚草的气体交换特性.     

基于水环境容量的寇河流域生态补偿标准

沿途工业、农业和生活污水造成寇河水体污染,不仅降低了水体的使用功能,还直接影响清河的水质.加之缺乏有效的管理,导致寇河流域出现水资源利用不合理、水环境污染严重的现状.本文以寇河流域可持续发展为目标,确定西丰县与开原市2个控制单元,选取化学需氧量(COD)为污染因子,计算出寇河流域水环境容量,结合河流水质监测数据、河流环境功能分区、污染普查数据、COD恢复成本,确定了寇河流域的生态补偿标准.结果表明：在50%保证率、75%保证率、近10年最枯月平均流量(30Q10)保证率下,西丰县应向下游开原市补偿的标准分别为390.9×10⁴、448.6×10⁴、514×10⁴ yuan·a^-1.提出了生态补偿资金筹集、分配、监督相结合的寇河流域生态补偿机制的建议.     

赤皮青冈幼苗叶片解剖结构对干旱胁迫的响应

以浙江庆元、湖南洞口和湖南靖州3个种源的赤皮青冈1年生幼苗为材料,采用盆栽称量法控制土壤水分含量,设置土壤相对含水量分别为75%～80%(对照)、55%～60%(轻度干旱胁迫)、45%～50%(中度干旱胁迫)和30%～35%(重度干旱胁迫),研究不同程度干旱胁迫对赤皮青冈幼苗叶片解剖结构和蒸腾作用的影响.结果表明: 干旱胁迫下,3个种源赤皮青冈幼苗叶片的总厚度、上下表皮厚度和栅栏组织厚度均显著降低.栅栏组织厚度与海绵组织厚度比(栅海比)、气孔长度和宽度随干旱程度的增强而显著减小,而气孔密度随干旱胁迫程度的增强而显著增加.干旱处理对叶片主脉厚度无显著影响,木质部厚度的变化因种源而异.叶片结构的变化引起生理功能改变,随着胁迫程度的加强,赤皮青冈幼苗的蒸腾速率显著降低.对照和各干旱处理湖南洞口种源幼苗叶片的下表皮厚度、栅海比、气孔密度显著大于其他2个种源,蒸腾速率显著小于其他2个种源,表明湖南洞口赤皮青冈对干旱胁迫的适应性较强.