松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因的克隆、原核表达及在不同滞育阶段的表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi一氧化氮合酶(NOS)基因,表达其编码蛋白,并探究其在松毛虫赤眼蜂滞育过程中的表达模式,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】通过转录组数据分析获得松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因TdNOS cDNA序列,使用qPCR方法检测其在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段预蛹和蛹中的表达量。使用RT-PCR方法扩增TdNOS cDNA序列并通过生物信息学方法分析其序列特征。构建TdNOS的原核表达载体,利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达重组TdNOS蛋白,通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,并用于制备多克隆抗体。利用Western blot进一步检测TdNOS在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段的表达量。通过质谱鉴定纯化的目标蛋白。【结果】qPCR分析表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的相对表达量显著高于其他阶段的。克隆获得松毛虫赤眼蜂TdNOS cDNA序列(GenBank登录号:MN650600),开放阅读框(ORF)序列长1 014 bp,编码337个氨基酸,无信号肽序列,不含跨膜结构,预测有33个丝氨酸磷酸化位点、7个酪氨酸磷酸化位点和10个苏氨酸磷酸化位点。系统发育分析表明,松毛虫赤眼蜂NOS与短管赤眼蜂T.pretiosum NOS亲缘关系最近,形成与其他膜翅目昆虫NOS蛋白分离的独立分支。成功表达纯化了重组蛋白TdNOS并制备了抗体;Western blot结果表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的蛋白表达量高于其他阶段的。质谱检测结果表明纯化的目的蛋白即为TdNOS。【结论】松毛虫赤眼蜂TdNOS在解除滞育后蛹期具有较高的蛋白及mRNA表达量。本研究为进一步探究松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶在滞育发育过程中的作用机制奠定了基础。     

平顶山市2004—2011年百日咳流行特征分析

目的了解平顶山市百日咳发病流行规律,为有效防控百日咳提供科学依据。方法采用描述流行病学方法分析,对平顶山市法定传染病报告系统和近年对百日咳疫情监测资料进行分析,对百日咳的时间分布、疫苗效果等进行比较。结果自实施计划免疫以后,百日咳发病率和死亡率大幅度下降,年均发病率由20世纪60～70年代的93.08/10万降至目前的1/10万以下;流行范围逐步缩小,春夏为高发季节,主要集中在5～8月份,病例10岁以下儿童共88例,占病例总数的98.88%,主要集中在7岁以下的为57例,占64.05%。城市高于农村,两者发病率差异有统计学意义。女性多于男性。职业以散居、托幼儿童为主,占发病总人数的57.30%;其次为学生,占41.58%。结论防治百日咳应进一步提高和保持高水平的百白破混合制剂常规免疫接种率,控制局部地区的爆发,并加强监测和传染源的管理。     

鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其性质研究

首先对鲤鱼鱼皮的成分进行了研究,通过凯氏定氮、索式抽提、高温灰化、直接干燥法测定了鱼皮的蛋白质、脂肪、灰分、水分含量。通过粘度测定法得到鱼皮胶原蛋白的变性温度为28℃左右;紫外可见光谱扫描的结果证明鱼皮胶原蛋白在228 nm有一最大吸收峰;SDS-PAGE电泳初步确定鱼皮胶原蛋白是I型胶原蛋白;酶解实验进一步证实了鱼皮同鱼鳞、鱼骨的胶原蛋白在结构上具有很大的相似性。     

复方新会陈皮含片药材提取工艺优选

目的 优选复方新会陈皮含片中甘草、桔梗药材的水提取工艺条件。方法 采用单因素试验和正交试验法,以得膏率和甘草中指标性成分甘草苷、甘草酸的保留率为考察指标,高效液相色谱法测定甘草苷、甘草酸的含量;以加水量、煎煮次数、煎煮时间、浸泡时间为考察因素,优选提取工艺条件。结果 甘草、桔梗药材的水煮提取工艺优选条件分别为加水量9、8、8倍煎煮3次,每次2 h,不浸泡。验证试验指标成分甘草苷和甘草酸保留率分别约为87.0%、64.0%。结论 优选的提取工艺得膏率、甘草苷、甘草酸的含量较高,提取工艺稳定、合理可行。     

Harpin的表达及其诱导抗烟草花叶病毒感染的活性

采用人工分段合成梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)Harpin基因A、B、C、D片段,然后连接构建全长harpin基因,克隆到pET-23( )表达载体中,在E．coli BL21中表达Harpin蛋白。通过His Bind Resin Ni^ 层析柱纯化,获得Harpin蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,该蛋白分子量为45kDa。采用叶片穿刺法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发烟草叶片的过敏反应。采用叶脉注射法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发辣椒叶片的过敏反应。将烟草和辣椒用3μg／mL Harpin喷雾处理5d后,接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),观察植株病症,并采用ELISA检测TMV含量。结果表明经Harpin处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用。     

温室白粉虱在雪莲果和烟草上的生物学特性比较

温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)是雪莲果和烟草种植中主要害虫之一。雪莲果和烟草都是大叶寄主植物,本研究旨在比较温室白粉虱在雪莲果和烟草上的生物学特性,为利用雪莲果作为寄主植物大量繁育温室白粉虱和丽蚜小蜂提供参考依据。在人工气候室条件下,以雪莲果和烟草作为寄主植物繁育温室白粉虱,明确各龄期若虫的大小、发育历期、存活率、成虫产卵量和寿命。结果表明,温室白粉虱各龄若虫在雪莲果上均大于烟草上若虫;温室白粉虱在雪莲果上从卵到成虫发育需要19. 5 d,明显短于烟草上21. 1 d;在雪莲果和烟草上温室白粉虱卵到成虫的存活率分别为82. 0%和80. 0%,无显著性差异;温室白粉虱在雪莲果上单雌平均产卵量为166. 2粒,明显高于烟草上132. 7粒;温室白粉虱在雪莲果上雌、雄成虫平均寿命分别为31. 3 d和25. 0 d,明显长于烟草上27. 9 d和22. 0 d。本文研究结果表明,温室白粉虱在雪莲果上的生物学特性参数明显优于烟草,表明雪莲果适合作为大量繁育温室白粉虱的寄主植物,为进一步开发应用雪莲果为中间寄主植物大量繁育丽蚜小蜂提供了理论依据。     

Burkholderia sp. NCIMB 10467菌株中原儿茶酸3, 4-双加氧酶基因的分子克隆和生化特性研究（英文稿）

NCIMB 10467是一株木质素降解菌, 根据其16S rDNA序列将其重新分类为Burkholderia菌属。研究显示, 在NCIMB 10467菌株中, 不同的底物可以诱导该菌株对于原儿茶酸的多种代谢形式。根据克隆到的一段原儿茶酸邻位开环酶, 即原儿茶酸3, 4-双加氧酶(P34D; EC 1.13.11.3) a-亚基的保守序列, 通过染色体步移的方法, 得到一段9505 bp的DNA片段。序列分析显示, 在这段9.5 kb的DNA片段中, 两个可能的开放阅读框pcaG 和 pcaH分别编码P34D的a-亚基和b-亚基。将pcaGH克隆并在大肠杆菌中进行表达后, 可以检测到P34D的活性。而pcaH在NCIMB 10467菌株中的敲除则使该菌完全丧失了代谢原儿茶酸的能力。由此证实, 克隆到的pcaGH基因确实编码原儿茶酸3, 4-双加氧酶, 并且对于NCIMB 10467菌株对原儿茶酸的代谢是必需的。     

结核分枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定

【目的】鉴定结核分枝杆菌基因组上MazF同源蛋白基因与其上游基因是否组成毒素-抗毒素系统,阐明毒素蛋白的作用机理,并初步探讨毒素-抗毒素系统在营养缺乏时的表达调控。【方法】在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中将MazF同源蛋白单独表达或与其对应的抗毒素蛋白共同表达,鉴定MazF同源蛋白对细菌生长的抑制作用以及其对应的抗毒素蛋白能否消除这种生长抑制;通过体外RNA切割实验,检测MazF同源蛋白是否具有RNA切割活性;检测正常生长条件下和饥饿条件下毒素-抗毒素系统的启动子活性,探讨其在应激条件下的表达调控。【结果】结核分枝杆菌MazF同源蛋白中,Rv0659c、Rv1495和Rv1942c不具有抑制细菌生长的毒素蛋白活性,Rv1991c、Rv2801c、Rv1102c和mtPemK能够抑制细菌生长,而且它们的抑制作用可以分别被其对应的抗毒素Rv1991a、Rv2801a、Rv1103c和mtPemI解除。Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c具有RNA切割活性,mtPemK则不能切割RNA。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统的启动子在饥饿条件下活性显著升高。【结论】结核分枝杆菌基因组上Rv1991a-1991c、Rv2801a-2801c、Rv1103c-1102c和mtPemI-mtPemK是毒素-抗毒素系统。毒素蛋白Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c通过切割RNA发挥抑菌或杀菌活性,mtPemK具体作用机理目前还不清楚。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统可能参与结核分枝杆菌在营养匮乏条件下的生长调控。     

基准剂量软件BMDS中基准剂量下限的计算研究

基准剂量下限作为风险评估的参考点,是剂量评估的重要参数.对美国环境保护暑开发的基准剂量软件BMDS的2.2版中采用的似然比法计算基准剂量下限进行了研究,以二分Logistic模型为例,详细剖析了这种计算方法的运行机制,并将计算结果和BMDS软件的计算结果进行比较,验证了本文介绍方法的正确性.采用这种计算方法设计开发了我国的二分型基准剂量模型评估软件.     

海洋微生物几丁质酶分离纯化及其抗真菌活性

以实验室筛选的海洋产几丁质酶短芽胞杆菌属（Bacillus brevis sp．）菌株Bspl,经往复式摇床振荡培养96h后,发酵液先后采取了75％的硫酸铵盐析、透析、几丁质亲和层析、SDS—PAGE等方法对几丁质粗酶液进行分离纯化和鉴定。几丁质亲和层析一步纯化后,经过SDS—PAGE电泳测定该酶的分子量为23ku,其比活力为86．65．纯化倍数为1．707、产率为32．1％。纯化的几丁质酶能抑制病原真菌的生长,对病原真菌的拮抗作用具有广谱性。同时研究了几丁质酶的稳定性,以胶态几丁质为底物,分离的几丁质酶在pH7．5,55．0℃左右具有最大酶活性;Zn^2＋、Cu^2＋和Hg^2＋能强烈抑制几丁质酶活性;Ni^＋和EDTA抑制20％-40％;然而5mmol／LCo^2＋可以使几丁质酶活性提高1．4倍;Mg^2＋、Ca^2＋等也能使酶活性增加。