秦岭辛家山林区锐齿栎外生菌根真菌多样性

以秦岭辛家山林区锐齿栎为研究对象,通过野外调查结合形态学和分子生物学方法,观察和鉴定与其共生的外生菌根真菌。结果确定了3种子囊菌和48种担子菌,分属于10科14属,其中毛革菌属Tomentella是优势类群,丝伞盖属1 Inocybe 1、Russula persicina、毛革菌属1 Tomentella 1、毛革菌属2 Tomentella 2、块菌属Tuber、绒盖牛肝菌属Xerocomus是常见种,其余都为稀有种。两样地锐齿栎外生菌根真菌除丰富度指数外,Simpson指数、Shannon指数以及Pielou均匀度指数差异不显著;Jaccard相似性指数和Sorenson相似性指数分别为0.1154和0.2069。     

PCR条件对扩增SARS-CoV多聚酶部分基因的影响

目的：对该实验室已建立的检测SARS冠状病毒多聚酶基因的套式RT-PCR方法进行优化。方法：从SAPS病人的嗽口水标本中提取RNA,调整套式PCR的退火温度,扩增SARS冠状病毒多聚酶部分基因。扩增出的阳性片段连接入pGEM-T载体中,测序后比较其与已知SARS冠状病毒的同源性。结果：通过改变PCR条件,成功从一SARS病人的嗽口水中扩增出SARS冠状病毒多聚酶部分基因。结论：针对不同标本优化PCR反应条件非常重要。     

广东省豆科植物结瘤固氮及根瘤菌资源的初步研究

于2000～2001年在广东省境内54个县（市、区）进行了豆科植物结瘤固氮资源的调查及根瘤菌的采集工作。共采集到豆科植物根瘤样品484份,隶属于37属78种;根瘤的形状以圆形、椭圆形、珊瑚状和姜状居多,大小一般在1～10 mm之间,颜色多为淡红色或黄色。用乙炔还原法对24种93份根瘤样品进行了固氮酶活性测定,结果表明,大多数样品的固氮酶活性在1～10 μmol C₂H₄·g^-1 fresh nodule·h^-1之间。从采集到的根瘤中分离纯化出410株根瘤菌,对其中312株进行了回接试验,回接成功率为93.3 %。调查发现广东省现有栽培豆科作物种类与《广州植物志》的记载相似,所以本研究在豆科栽培作物方面有一定的代表性。在调查采集到根瘤的豆科植物中,三尖叶猪屎豆（Crotalaria micans）、毛排钱草（Phyllodium elegans）、细长柄山蚂蝗（Podorcarpium leptopus）等在本研究之前未见到有结瘤固氮的报道。     

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b和pBV222上,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性,可用于抗SARS抗体检测及亚单位疫苗研究。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

日本血吸虫新基因Sj-MA的克隆、表达及保护性免疫

为发现新基因 ,寻找日本血吸虫病新疫苗候选分子 ,采用Sj雄虫免疫血清筛选Sj成虫cDNA文库。经测序发现新基因Sj MA含有一个完整的阅读框 ,推测其由 2 4 9个氨基酸组成 ,编码分子量为 2 8.8kD的可溶性蛋白质 ,并带有多个能被磷酸化激活的位点 ,提示其可能为一重要的信息传递分子。将Sj MA的cDNA亚克隆至原核表达载体pGEX 5X ,获得Sj MA原核表达的重组体rSj MA/GST ,并在E .coli中高效表达为谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,分子量为 5 4 .8kD ,Western印迹显示融合蛋白质能被抗雄虫和抗GST血清识别。融合蛋白质免疫小鼠可诱导 34.2 9%的减虫率 ,与对照组有显著性差异 (P <0 .0 0 1 )。表明新基因Sj MA表达的蛋白质能诱导小鼠的抗日本血吸虫的保护性免疫 ,提示其作为日本血吸虫疫苗候选分子的潜在价值     

DLK1基因在急性白血病细胞系中的表达及其意义

目的:研究急性白血病细胞系DLK1基因的表达水平在红系分化中的作用.方法:采用RT-PCR、Western bitting时白血病细胞系K562、HL-60进行DLK1水平的检测.培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化.结果:K562细胞DLK1mRNA、蛋白水平存在明显表达,HL-60细胞DLK1则不表达.通过RT-PCR检测了hemin诱导K562细胞向红系分化过程中各时间点DLK1mRNA的变化,显示随着K562向红系分化,DLK1mRNA的水平逐渐下降.结论:K562细胞表达DLK1,HL-60不表达DLK1.DLK1基因可能参与K562细胞向红系分化的过程,可能抑制其分化.     

重组GIP蛋白的原核优化表达及其生物活性的研究

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide,GIP)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽,在高血糖背景下能够刺激胰岛素释放,能够抑制胃酸分泌、促进神经细胞增生,具有广泛的临床应用价值.化学提取或人工合成GIP,成本过高,不宜规模化生产,故应用基因工程技术研制重组人GIP(rhGIP)并探讨其生物活性有积极的现实意义.人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列,利用pET32a( )系统进行原核表达;在小规模发酵条件下,进行优化诱导表达和目的蛋白的亲和纯化;通过检测SD大鼠胃酸分泌和血糖浓度,对纯化后的rhGIP进行生理活性研究;通过形态学观察和培养基中NO含量测定,检测rhGIP对PC12细胞NO自由基生成量的影响;应用Aβ25-35加入培养基造成PC12细胞神经损伤模型,分别以高、中、低剂量rhGIP作用于此模型,通过MTT(2-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法测定PC12细胞的活性.结果显示,成功克隆了人GIP基因,诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%,部分可溶,部分以包涵体形式存在.经过诱导表达的重组蛋白质分子质量约为26ku,与理论值相符.纯化后的rhGIP具有免疫活性.优化诱导表达条件为表达菌生长密度A600值0.50,IPTG浓度0.5mmol/L,温度37℃,诱导表达时间4h.裂解上清液经固定化金属亲和层析一步法层析后,表达的水溶性rhGIP融合蛋白的最后得率为1.2mg/L菌液,纯度为85%.纯化后的rhGIP能够使SD大鼠胃液pH值增高,其抑制胃酸分泌作用与生理盐水对照组比较差异有显著性(P<0.05),而rhGIP组和标准品GIP组比较差异无显著性.在高血糖背景下,注射rhGIP15min后,大鼠血浆血糖浓度较基础血糖显著降低(P<0.05),30min时与单独注射葡萄糖的模型对照组比较,差异无显著性,而rhGIP组和标准品GIP组其差异不显著.在rhGIP对神经细胞的营养和对PC12细胞免受神经损伤和缺氧损伤影响的研究中发现,用rhGIP培养PC12细胞32h后,rhGIP组NO含量极显著低于正常对照组(P<0.01),细胞存活较多,神经突起延伸较好,中、高剂量rhGIP组均较神经损伤和缺氧损伤组活性显著升高(P<0.05),且细胞活性呈剂量依赖关系,rhGIP组与标准品GIP组差异不显著,与正常对照组亦无显著差异.研究结果表明,已得到高效表达的rhGIP融合蛋白,该蛋白质具有免疫活性,具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性,并且对神经细胞有营养和保护作用.     

兔眼越桔(杜鹃花科)花粉形态——兼谈用极坐标测量四合体花粉的一种新方法

扫描电镜下,兔眼越桔花粉为四合体,外形为准四面体,中等大小,表面具不规则皱波状纹饰,并有多处凹陷。萌发孔沟多为3对(顶分体3条,侧分体各对应1条),以四面体几何中轴为中心,中心对称分布于四面体的3个侧面。萌发孔沟的长度、宽度、孔盖长与宽、孔盖的形状、突起的程度等,在个体间有差异,尤其是一些具有多处凹陷的花粉粒,可能是导致花粉萌发率不同的生态类型。用极坐标法描述四合体花粉的新方法可以表现其饱满度,比较传统上用极轴、赤道轴的长短表现花粉平面大小的方法,更加准确而直观。     

PRRSV受体CD163的原核分段表达

为原核表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)受体CD163,本研究根据CD163基因序列(EU016226),通过生物信息学软件Scanprosite预测了CD163结构特征并进行分段。利用DNAstar软件设计合成3对特异引物,从猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAM)中克隆CD163三个片段,经测序鉴定正确后,分别克隆于原核表达载体pET-28a(+),在IPTG诱导下,进行CD163重组蛋白的截短表达,经Western杂交检测证实表达的三段截短蛋白均具有良好的与抗原反应活性,从而为进一步研究CD163受体在病毒感染过程中的作用以及与其他受体之间的相互作用提供实验依据。