利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

阴道毛滴虫多克隆抗体的制备及Fd基因的原核表达

目的 将阴道毛滴虫铁氧还蛋白（ferredoxin,Fd）基因在大肠埃希菌中诱导表达。方法制备阴道毛滴虫可溶性抗原,多点注射免疫家兔,获得的血清用ELISA测定其抗体效价。将原核表达重组质粒pET3C-Fd转化入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。结果制备出抗阴道毛滴虫多克隆抗体,抗体效价在1：8000以上,用于免疫印迹实验。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。     

阴道毛滴虫症状株和带虫株黏附蛋白33基因的克隆和序列比较

目的分析和比较阴道毛滴虫症状株和带虫株黏附蛋白33基因序列。方法提取阴道毛滴虫各分离株基因组DNA,PCR扩增目的基因,构建重组质粒,克隆,鉴定和序列比较。结果黏附蛋白33基因长度约为930bp,成功构建pMD-18T-ap33重组质粒。同GenBank上的黏附蛋白33基因序列比较,症状株黏附蛋白33基因序列与已知序列有2个碱基不同,而带虫株黏附蛋白33基因序列与已知序列有1个碱基存在差别。结论阴道毛滴虫症状株和带虫株黏附蛋白33基因序列存在差异。     

HO-1在U2OS细胞DOX耐药中的作用及分子机制研究

目的:探讨血红素氧合酶-1(HO-1)在骨肉瘤U2OS细胞多柔比星(DOX)耐药中的作用及相关分子机制。方法:体外培养U2OS细胞,建立U2OS-DOX耐药株,分为U2OS-WT组和U2OS-DOX组。采用siRNA HO-1转染U2OS-DOX细胞,CCK-8法检测细胞活性;RT-PCR法检测缺氧诱导因子1(HIF-1α)及HO-1的mRNA表达;WB法检测HIF-1α及HO-1的蛋白表达水平;流式细胞仪检测罗丹明Rh123在细胞内的蓄积。结果:DOX可降低U2OS细胞活性并随剂量的增加愈加明显,这种诱导作用可以被抗氧化剂(NAC)所逆转(P<0.01)。U2OS-DOX组HIF-1α及HO-1的mRNA和蛋白表达以及P糖蛋白(P-gp)表达水平均显著增加(P<0.05)。转染可恢复U2OS-DOX细胞对DOX化疗敏感性并增加其对Rh123的蓄积(P<0.001)。结论:HO-1可能通过抗氧化应激、增加化疗药物的蓄积等机制发挥U2OS细胞对DOX的耐药性。     

抗体信息数据库北大核心CSCD

抗体是介导体液免疫的重要效应分子。近年来,随着治疗性抗体药物不断上市及其临床应用范围不断拓宽,治疗性抗体已成为生物制药的产业支柱。另一方面,随着抗体相关的基础研究日益深入和抗体序列、结构、功能表位等相关数据大量涌现,作为抗体数据管理、搜索与利用的重要工具,抗体资源库也层出不穷并得到长足发展,在相关的研究、开发、生产与销售中发挥日益重要的作用。本文对包括Kabat、IMGT、ab Ysis等在内抗体信息数据库进行介绍。     

小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4的胞外肽段表达及纯化

目的: 真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine 2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Western blot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。     

辽宁和尚帽自然保护区寄蝇科昆虫资源调查

对我国东北地区辽东和尚帽自然保护区寄蝇科昆虫资源进行调查.采用形态分类方法,进行标本整理、鉴定出寄蝇科4亚科21族90属177种,分别占中国已知族、属和种类的53.85％、32.03％和13.80％,其中金龟长喙寄蝇Prosena siberita,暗黑柔寄蝇Thelaira nigripes,伪利索寄蝇Lixopha...     

应用KV-CBCT分析鼻咽癌调强放射治疗的摆位误差

目的:应用KV-CBCT分析鼻咽癌调强放射治疗时的摆位误差,为鼻咽癌调强放射治疗计划设计时CTV外扩PTV边界的大小提供参考。方法:选取30例IMRT的鼻咽癌患者,治疗过程中每周一次应用KV-CBCT采集患者治疗前的CT图像,将所得图像与定位CT图像进行匹配,分别测定X、Y、Z轴三个方向的摆位误差。结果:30例患者共拍摄168次KV-CBCT,获得168组摆位误差结果,群体摆位误差分别为X轴-0.15±1.43 mm,Y轴0.20±1.58 mm,Z轴-0.21±1.65 mm;根据Van Herk公式计算得到各方向的CTV-PTV外放边界值X、Y、Z轴分别为3.1 mm、3.3 mm和3.4 mm。结论:应用KV-CBCT影像系统可实时测量摆位误差并在线进行纠正,减小摆位误差,为CTV-PTV外放边界提供参考。     

加工方法对毛豆中大豆异黄酮苷元含量的影响及其对糖尿病小鼠的降血糖降血脂活性研究

本文比较不同处理方式下毛豆中大豆异黄酮苷元的含量,继而对冻干条件下处理的毛豆样品进行降血糖降血脂活性的研究。采用高效液相色谱(HPLC)法测定通过热烫、煮沸、冷冻、冻干、烘干从毛豆中提取出的大豆异黄酮苷元的含量。HPLC测定条件如下:色谱柱:Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇-0.3%磷酸溶液(48∶52),流速:0.7 mL/min,测定波长:260 nm,柱温:25℃,进样量:20μL。留一组健康小鼠作为空白,将造模成功的ICR小鼠随机分为3组,分别用生理盐水,消渴丸,冻干毛豆,对其连续灌胃4周,4周后处死,测定其血糖和血脂指标。结果显示,冻干条件下,大豆异黄酮苷元含量最多(115.45μg/g),并且冻干的毛豆能够显著改善糖尿病小鼠的血糖和血脂水平。     

兰州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因,并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性,为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列,并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA序列全长1 397 bp,其CDS区片段长1 102 bp,编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD,理论等电点为8.82,为非跨膜的疏水性蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点,3个糖基化位点,3个磷酸化功能结构域,4个其他结构域,1个LCR片段,二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列(登录号:NM_001139455.1)相比,其第852位发生碱基转换(CA),导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换(ST),同时,第951位发生碱基转换(TG),但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性,其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上,导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化,为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。