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采用人工分段合成梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)Harpin基因A、B、C、D片段,然后连接构建全长harpin基因,克隆到pET-23( )表达载体中,在E.coli BL21中表达Harpin蛋白。通过His Bind Resin Ni^ 层析柱纯化,获得Harpin蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,该蛋白分子量为45kDa。采用叶片穿刺法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发烟草叶片的过敏反应。采用叶脉注射法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发辣椒叶片的过敏反应。将烟草和辣椒用3μg/mL Harpin喷雾处理5d后,接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),观察植株病症,并采用ELISA检测TMV含量。结果表明经Harpin处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用。 相似文献
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鲤鱼生长激素GH是鲤鱼生长腺体分泌并促进鲤鱼生长的一种分泌蛋白.对虾白斑综合病毒(WSSV)VP28蛋白为囊膜蛋白,是病毒感染宿主的必需因子.根据gh和vp28的上下游序列,分别设计合成两对引物,PCR扩增gh和vp28基因,将基因gh和vp28按先后次序融合后插入穿梭质粒pPIC6αC多克隆位点,构建成重组分泌表达穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28),用Bstx1单酶切穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28)线形化,转化毕赤酵母X-33.重组菌株30℃甲醇诱导,实现在酵母中的融合分泌表达,获得融合蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测和Western Blot印迹鉴定,显示与预期大小66kD相吻合的融合蛋白带.用Ni2 -柱纯化后的基因工程蛋白注射鳌虾进行蛋白生物功能测试,结果表明该蛋白获得了促鳌虾生长和抗WSSV感染的双重功效. 相似文献
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油茶尺蠖(Biston marginata Shirabi)属鳞翅目,尺蠖科,是危害油茶树的主要害虫。近年来,油茶尺蠖已迁移到茶园中,在湖南、湖北等地猖獗成灾,现已成为危害茶树的主要害虫之一。油茶尺蠖一年有几代,而且世代重叠,加之对化学农药具有较强的抗性,给茶叶生产带来了重大经济损失。 相似文献
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KB细胞经PDBu刺激 ,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA ,RT PCR法获得重组人白介素 12 (rhIL 12 )P35和P4 0cDNA。将hIL 12P35cDNA和P4 0cDNA分别克隆到 pAcUW 5 1载体的Polyhedrin和P10启动子下游 ,构建 pAcUW 5 1 IL12转移载体。pAcUW 5 1 IL12与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染Sf9细胞 ,获得重组杆状病毒Ac hIL12。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫 ,采用亲和层析法纯化rhIL 12 ;SDS PAGE(银染法 )、Westernblot鉴定表达和纯化的产物 ;ELISA检测rhIL 12含量 ;MTT法检测rhIL 12样品生物活性。rhIL 12分子量为 75kD。rhIL 12在Sf9细胞培养中表达水平为 17.8μg/10 6细胞 ;在银纹夜蛾幼虫中表达水平为 2 0 0 - 30 0mg/L血淋巴。纯化的重组rhIL 12样品对经PHA P激活的PBMC有明显的增殖活性 ,且具有明显的促NK细胞杀伤活性的生物活性 相似文献
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棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达 总被引:9,自引:0,他引:9
以棉铃虫颗粒体病毒(Helicoverpa armigera granulosis virus,简称HaGV)基因组DNA为模板,设计引物PCR扩增病毒增效蛋白(Enhancin)基因,然后经SacI/PstI双酶切消化,得到5′端截短的约2.1kb增效蛋白基因片段,再与pQE30质粒连接,构建了重组表达载体pQE/EnC,转化大肠杆菌M15(pREP4),在IPTG诱导下表达出分子量约为78×103 D的融合蛋白并命名为P78,纯化的P78包涵体显示了明显的增效活性,可提高AcMNPV对小菜蛾幼虫的感染率27.88%~32.92%。 相似文献
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昆虫杆状病毒增效蛋白(enhancin)曾被称为病毒促进因子(synergisticfactor,SyF)或病毒增效因子(viralenhancingfactor,VEF),它长期以来被认为只存在于昆虫颗粒体病毒(Granulosisvirus,GV)中的一类蛋白质,已知有8种GV中含有增效蛋白。自Tanada[1~4]1959年从美洲一星粘虫(Pseudaletiaunipuncta,Pu)GV中分离出增效蛋白并证实它有增强PuMNPV的感染力后,一直很受人们关注。从它的作用机理到氨基酸序列… 相似文献
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将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA.根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3′末段设计一对引物进行PCR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变.但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T→C,517A→G以及630C→T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T.以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变. 相似文献
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