表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8;中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。     

SV40病毒的培养、增殖及鉴定

目的：建立SV40病毒在Vero细胞上培养的方法,观察其生长过程,获得SV40病毒,并建立相应的SV40病毒检测方法,为SV40灭活疫苗的制备奠定良好的基础。方法：在Vero细胞上培养和增殖SV40-776株病毒。收获病毒后,应用PCR、免疫荧光以及克隆特异性片段进行测序比较来鉴定SV40病毒。结果：SV40在Vero细胞中增殖很快,并且使细胞出现明显的病变。小规模分离到了SV40病毒颗粒,获得了病毒DNA。不同的鉴定方法均显示出良好的特异性。结论：探讨了SV40病毒病变的基本过程,建立了病毒的培养、增殖和鉴定的方法。     

苍耳等48种植物提取物的杀虫活性

采用浸虫法测定了48种植物的丙酮提取物对小菜蛾（Plutella xylostella L．）的杀虫活性,并研究了苍耳（Xanthium sibiricum Patrin．）不同溶剂提取物对小菜蛾和棉蚜（Aphis gossypii Glover）的触杀作用以及苍耳丙酮提取物不同溶剂萃取物对小菜蛾的触杀作用。结果表明,在供试的48种植物中,500g·L^-1黄花蒿（Artemisia annua L）、泽漆（Euphorbia helioscopia L．）、夏至草[Lagopsis supina（Steph．ex Willd．）Ik．-Gal．ex Knorr．]、苍耳及律草[Humulus scandens（Lour．）Merr．]的丙酮提取物对小菜蛾的杀虫活性较强。在苍耳的不同溶剂提取物中,苍耳丙酮提取物的杀虫活性最强,乙醇和乙酸乙酯提取物的杀虫活性次之。另外,50g·L^-1苍耳丙酮提取物的氯仿萃取物对小菜蛾的杀虫活性最强,24h和48h的校正死亡率分别为88．33％和91．67％。     

细胞膜的形貌结构及其功能信息

利用原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）比较观察了从冬小麦（Triticum aestivum）叶肉细胞中分离的生活原生质体和失水死亡的原生质体质膜的表面特性．其结果表明,生活原生质体质膜显示极性化状态,不同的细胞及区域质膜脂质分子层的活性状态不同,质膜表面凸凹不平,具有明显的区域化结构．有的细胞质膜表面呈现规则的网格状结构,似脂质与蛋白质结合的复合体,经测定这种结构的直径为（15．8±0．09）nm,高度为（1．9±0．3）nm．通过二维和三维角度观察,在分离的生活原生质体质膜表面上分布着许多颗粒状物．经蛋白酶的处理和作用后,这种质膜表面的颗粒状物普遍发生了构象变化,大的颗粒状物变得松散,宽度增加,高度明显降低．显示这些颗粒状物可能为膜表面的嵌镶蛋白．这些质膜蛋白块大小不等,分布不规则,大的蛋白块直径约在200～440nm之间,高度为28～50nm;中等大小的蛋白块直径在40～60nm之间,高度在1．8～5nm;而小蛋白质颗粒直径为12～40nm,高度在0．7～2．2nm．大的蛋白质块上有微孔．此外,分离的生活原生质体质膜表面存在着许多由内吞作用形成的“内陷穴”,一般在15gm。的质膜上有16个大小不等的穴．较大的穴口平均直径为139nm,深度为7．2nm,较小的穴口直径平均是96nm,深度为2．3nm．原生质体失水死亡后,质膜表面极性化状态降低,质膜出现皱褶,脂质分子层结构信息显示扁平状态,嵌镶的蛋白质颗粒少．在这种脱水死亡的原生质体质膜表面上仍能观察到内吞作用形成的内陷穴,但由于原生质体脱水形成皱褶,穴的口径缩小,深度增加．一般大的穴口平均直径为47．4nm,深度为31．9nm;小口径直径为26．5nm,深度为43nm．经测量冬小麦细胞质膜厚度为6．6～9．8nm,有蛋白质的区域较厚．     

渗透压敏感和耐高渗酵母菌在海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊中的生长和代谢

为了研究微囊微环境中渗透压对微囊内不同渗透压敏感性细胞生长、代谢的影响, 分别以渗透压敏感型酿酒酵母Y02724与耐高渗酵母Hansel为细胞模型, 考察了有氧条件下这两种细胞在海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸(Alginate-chitosan-alginate, ACA)微胶囊中的生长、代谢状态。主要检测了细胞比生长速率、最大产物生成量以及代谢物乙醇、甘油分泌量等的变化。实验结果分析表明, 渗透压胁迫可能是导致不同渗透压敏感性细胞在微囊微环境中生长代谢特征变化的因素之一, 即微囊微环境内可能存在渗透压胁迫。     

秦岭山区虹鳟寄生三代虫一新纪录

记述了秦岭山区寄生于虹鳟的单殖亚纲一新纪录种：细鳞鲑三代虫Gyrodactylus brachymystacis Ergens,1978,比较了其与我国东北寄生于虹鳟的细鳞鱼三代虫Gyrodactylus lenoki Gussev,1953的区别。初步判断其来源可能一是通过水源来源于秦岭的细鳞鲑,另一种是通过早期虹鳟的引进带人的,其真实的途径及其对环境的风险性还有待于进一步研究。     

转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(NicotianatabacumL.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptII)及石蒜凝集素基因(lra)。通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株。Westernblot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同。对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔31的分离比方式遗传。抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用。首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性。石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用。     

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染临床流行病学

目的:了解产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌(Kpn)和大肠埃希菌(Eco)感染的影响因素.方法:根据我院实验室登记的各种标本中细菌培养的阳性报告,回顾调查了1999年2月～2000年12月在我院住院的201份病历.结果:201份病例送检的标本中,检出产ESBLs细菌76株,检出率37.8%(其中Kpn 25株,Eco 51株).非产ESBLs细菌为125株(其中Kpn 24株,Eco 101株).多因素分析结果表明侵袭性操作、第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类药物的应用、医院感染为产生ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌感染的危险因素(OR值分别为2.314、3.433、2.276、2.665);而基础疾病、免疫抑制剂、喹诺酮类药物的应用,与产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌感染无统计学意义(P＞0.05).结论:影响产ESBLs菌感染的临床危险因素为第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类药物的应用、医院感染、侵袭性操作.