头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。     

地中海诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶的纯化和性质

采用硫酸铵分部沉淀、DEAE纤维素-52柱层析和亲和蓝柱层析的方法,分离纯化了地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)U-32丙氨酸脱氢酶(ADH),用聚丙烯酰胺凝肢电泳鉴定为单一组份。以聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳测得丙氨酸脱氢酶的分子量为228000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其亚基分子量为38000,表明地中海诺卡氏菌U-32丙氢脱氢酶由六个相同的亚基组成。ADH加氨反应最适pH为8．5,脱氨反应最适pH为11．5,ADH的pH稳定范围在pH 7．5-11．5。脱氨反应的最适温度为50℃。ADH的米氏常数KM为：丙酮酸4．88×10-4mol／L;NH+44．03×10-3Mol／L;NADH 6．02×10-5Mol／L;L—Ala7．45×10-3mol／L;NAD+6．67×10-5mol／L。 Hill作图法求得ADH的Hill系数n为：ADH对丙酮酸、NADH和NAD+的Hill系数都为1;对L—Ala和NH4+的Hill系数n值分别为0．52和0．51,ADH对L—Ala和NH+4有负协同效应,由此初步推测ADH是一个调节酶。     

球形芽孢杆菌Ts-1原生质体电诱导质粒转化研究

本文探讨了球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus Ts-1原生质体电诱导质粒pHV 33转化的最佳条件：3个连续的间隔为1秒,时程为10μs,强度为21Kv／cm的脉冲,使其转化频率为2．44×102转化子／μgDNA,转化效率为3．16×10-6,质粒转化吸附的饱和浓度为5μg／l03CFU。利用此条件,将重组杀蚊毒蛋白克隆pJB41 7转入Bacillus subtillis 168M和Bacillumphaericus Ts-1中,使得B．Sublilis有了杀蚊活性,但未能提高Ts-1的毒性。     

地中海诺卡氏菌突变株生化互补和力复霉素合成途径的研究III．力复霉素生物合成中间产物的定量生物测定

中国科学院上海植物生理研究所 上海     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅰ.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用

本文报导了硝酸盐促进力复霉素生物合成现象的初步观察结果。加入硝酸钾0.8％,地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)NG 12—4合成力复霉素SV的产量可增加1.7倍。在发酵96小时之前加入硝酸盐均能促进力复霉素SV的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低。硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对力复霉素SV的合成与菌体生长之间起着调节作用。 洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了力复霉素合成所需要的酶系,蛋白陈不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用。在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进力复霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐所诱导的酶系的合成。 铵盐明显地抵消了硝酸盐对力复霉素合成的促进作用,可能是由于铵盐阻遏了硝酸还原酶的合成。 KNO~3~-菌体与-KNO~3~-菌体的形态有明显差别。两种菌体的脂肪含量也不相同。 KNO~3~-一菌体的脂肪含量为5.7％,而-KNO~3~-菌体则高达13.6％,看来硝酸盐在脂肪合成与力复霉素合成两条途径之间起着调节作用。     

林肯链霉菌合成林可霉素代谢调节的研究

在摇瓶条件下研究了葡萄糖、铵盐、磷酸盐对林可霉素产生菌林肯链霉菌的生长及林可霉素生物合成的影响。发酵过程中林可霉素的合成主要发生在菌体生长期,逐渐下降。使用6%的葡萄糖未发现通常所说的“葡萄糖效应”。0.2%铵盐有利于细胞生长,但0.8%NH+4对林可霉素的生物合成具有抑制作用。发酵48h后补加0.6% NH^＋_４,对林可霉素的生成没有显著影响。0.05%～0.1%磷酸盐对林可霉素合成具有较强的抑制作用。并就磷酸盐对菌体由初级代谢转向次级代谢的作用作了初步考察。     

林肯链霉菌谷氨酸合酶的纯化和性质

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和吸附层析等方法 ,分离纯化了林肯链霉菌谷氨酸合酶 ,电泳鉴定为单一组分 .这是链霉菌中的第 1例 .谷氨酸合酶很不稳定 ,向酶缓冲液中加入α -KG ,PMSF ,EDTA ,β 巯基乙醇和甘油可以大大提高其稳定性 .测得全酶分子量为 1 38ku ,亚基分子量为 81和 5 7ku ,表明该酶由2个不相同的亚基构成 .吸收光谱在 380和 440nm附近没有吸收峰 ,表明该酶是不含铁的非黄素蛋白质 .该酶反应的最适 pH为 7 .2 ,最适温度为 30℃ .该酶对NADH ,α KG和L -Gln的表观Km 值分别为 5. 2 1× 1 0 ^-5 ,4. 1 7× 1 0 ^-4 和 4. 35× 1 0 ^-4 mol/L .以NADPH代替NADH作电子供体 ,该酶仍表现出部分活力 .反应产物Glu和NAD⁺,部分金属离子、氨基酸及三羧酸循环中间物对该酶活力有不同程度的抑制作用 .     

GL一7一ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp．130)染色体上克隆得到的6．8kb的GL－7－ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、HindⅢ、claⅠI切点,分别具有一个HpaⅠ、两个xhoⅠ、三个BamHⅠI以及四个Pst I切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL一7一AcA酰化酶基因已被定位在3．Okb的B 2－B3－Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYCl84、pDR540、pUCl9等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMRl0和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMRl0的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMRll),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。