重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定

人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI_1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI_1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI_1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI_1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI_1-161 表达为TFPI1_1-161 (2 4kD)和TFPI_1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI_1-161(2.4kD)和1.8gTFPI_1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测,重组FTPI_1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI_1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。     

一种固定化酶的新载体——对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂

1.8%琼脂经环氧氯丙烷交联后,在碱性条件下与对β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应制得了对氨基苯磺酰乙基-(ABSE)-交联琼脂。醚化反应最适pH 是10。控制SESA 加入量制得含有107～1216微克分子苯胺基/克干重琼脂载体。2.ABSE-交联琼脂经重氮化后可在pH6.4～8.0偶联核酸酶P_1,每克琼脂可结合105～120毫克核酸酶P_1,固定化酶活力为4280单位/克干重固定化酶。活力回收可达18～35%。3.偶联时硫酸铵的存在可稍微提高固定化核酸酶P_1的活力,但其稳定性却比对照的差。4.载体上苯胺基含量过多会不利于所固定化的酶显示活力;用α-萘酚封闭残留的苯胺基,可以明显增加固定化酶的稳定性。     

短序十大功劳基因组总DNA提取方法研究

以短序大功劳嫩叶为材料,采用CTAB法、CTAB改良法1、CTAB改良法2、SDS法和试剂盒法五种方法提取短序十大功劳基因组总DNA,用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的纯度和得率,用ISSR-PCR扩增的方法检测所得总DNA的质量。结果表明,五种方法均能从短序大功劳叶片中提取到基因组DNA,但不同方法提取得的基因组DNA的纯度、浓度和得率存在明显的差异。CTAB改良法2和试剂盒法提取的DNA纯度高,可直接用于下游分子生物学实验,CTAB法、CTAB改良法1和SDS法提取的总DNA质量较差,不利于下游的分子生物学实验;五种方法提取的总DNA的得率在10.836~451.709μg/g之间,呈CTAB法>SDS法>CTAB改良法1>CTAB改良法2>试剂盒法的现象。此实验获得的结果可以为短序十大功劳分子生物学研究提供基础。     

重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定

人组织因子途径抑制物(TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI1-161包括TFPI的N末端、K1和K2结构域,是一种研究TFPi结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒pGEM-3Zf(-)-TFPi为模板,用PCR方法获得TFPI1-161基因,构建表达质粒pPIC9K-TFPi1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI1-161经纯化后最终产量高于酿酒酵母20倍以上。由于糖基化程度不同,TFPI1-161表达为TFPI1-161(24kD)和TFPI1-161(27kD)两种分子形式,其等电点分别为4、8和4．9。根据等电点差异,二可通过阴离子交换层析得到分离,其活性无显性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后,从4L发酵培养液中可分别获得1.4g TFPI1-161(24kD)和1.8gTFPI1-161(27kD),其比活性分别达12880u／mg和12400u／mg,回收率达55％。经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测,重组TFPI1-161具有良好的抗凝及抑制FXa活性的作用。为获得大量TFPI1-161提供了一种廉价高效的蛋白表达纯化方式,为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。     

斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列活性和调控研究

分别以斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio L.)为研究材料,通过克隆斑马鱼和鲤miR-1-2和133a-1的基因间增强子序列,利用活体和离体实验探讨其是否具有肌肉特异性;并通过荧光素酶报告系统等研究转录因子MyoD是否调控该序列。研究结果显示:在活体实验中,无论斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列均有肌肉特异性,且保留有保守区域(cr,含有E-box)的序列,注射72h后GFP表达量明显高于其他突变体。体外细胞实验也显示,转染含有cr序列的实验组,分化后的荧光素酶活性明显高于分化前。进一步探讨MyoD对miR-1-2/133a-1基因间序列的调控作用结果显示:无论是斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列活性均受MyoD调控。结果为完善鱼类肌肉发育机理,及未来的鱼类分子育种奠定基础。     

嗜硷性芽孢杆菌硷性蛋白酶的研究——Ⅲ.产品的急性毒性及微核试验

为了解嗜硷性芽孢杆菌(Bacillus basophilus)硷性蛋白酶用于洗涤剂中的安全性,对该酶进行了急性毒性及微核试验的研究。结果表明,嗜硷性芽孢杆菌硷性蛋白酶由小鼠经口剂量达10g/kg时,未见动物死亡;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验,未见微核率有异常增加。所以,认为嗜硷性芽孢杆菌硷性蛋白酶可广泛应用于洗涤剂中。     

东亚飞蝗Locousta migratoria manilensis(Meyen)的骨骼肌肉系统Ⅱ.胸部(续)

胸部的肌肉除包括胸节内及胸节之间的肌肉外,还包括活动头部、颈部以及附肢的肌肉,活动头部及颈部的肌肉位于前胸,在本文的第一部分头部中已经记述(55—66),这里须补充三对位于颈部腹面的肌肉(67、68、69)。     

中国及越南铁甲虫新种记述

本文记述铁甲虫新种17个,新亚种4个,其中有两个新种采自越南,其余均为国产。模式标本保藏在中国科学院动物研究所。 Anisodera rugulosa Chen et Yu,新种 体长,较阔。背面褐黄至褐红,微具光泽;触角、足及腹面黑褐至黑色,腹部2—4节后缘及末节褐黄。头顶复眼间隆起不明显,具刻点,中央有一细纵沟,额唇基中央无纵隆起,上唇基缘凸出,前壁平削并带光泽。触角长度几达体长之半,基部1—6节背面、1—4或     

相思鸟属亚种分类问题商榷(雀形目:鹟科)

相思鸟属Leiothrix,隶于雀形目、鹟科、画眉亚科。本属计有银耳相思鸟和红嘴相思鸟两种,我国均有分布。 一、银耳相思鸟Leiothrix argentauris(Hodgson) 据Deignan(in Mayr et Paynter,1964)L.argentauris计有10个亚种,已有文献记