基于PTS缺陷型大肠杆菌构建莽草酸生产菌

对大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径进行代谢流改造, 以实现高效的生物制备莽草酸。以磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS系统)敲除菌DH5α△ptsHIcrr (DHP)为基础, 特异性敲除aroL、ydiB基因并转入受阿拉伯糖诱导表达的T7-RNA聚合酶基因, 最终构建一系列产莽草酸宿主菌。再将aroE、aroB、tktA、glk、aroFfbr组成的系列基因串联起来置于质粒上, 在T7启动子控制下表达, 经摇瓶培养检测得知, 不同重组菌产莽草酸能力与对照相比均有明显提高, 其中DHPYA-T7/pAOC-TGEFB菌株产量最高, 可达到392 mg/L。为进一步构建高表达莽草酸工程菌奠定基础。     

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌 (Enterobacteraerogenes)突变株EAM Z1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶 (UPase)。经测定这种Upase的分子量为 1 2 .8× 1 0 4,亚基分子量为 4 .3×1 0 4,由 3个同型亚基组成。N端氨基酸序列为 :MRMVDLIATKRDGGE。等电点为 4 .46。对尿苷的Km为 0 .2 9mmol L。酶反应的最适pH为 7.8,最适温度为 50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5 氟尿苷、2′ 脱氧 5 氟尿苷及尿嘧啶 β D 阿拉伯呋喃糖 ,且具有较高的转移酶活性 ,能将尿苷和 5 氟尿嘧啶转化成 5 氟尿苷 (一种抗癌药物的中间体 ) ,其转化率为 47%。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用

Red同源重组技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源重组的重组机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源重组在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。     

两水相萃取法从重组大肠杆菌匀浆液中提取干扰素α1的研究

本文以PEG磷酸酯／磷酸盐两水相系统,经两次萃取从重组大肠杆菌匀浆液中提取干扰素α1。最适萃取条件为22％PEG磷酸酯t 16%磷酸盐,3％NaCI,pH6．9。IFNαl的分配系数达到155,收率9g．6％,纯度提高25倍;对反萃取条件作了初步研究,较好的条件为20％PEG磷酸酯,10％磷酸盐,pH6．0,收率达到75．6％,但浓度有所稀释。与传统的提取方法相比,本法可省去高速离心去除细胞碎片的步骤,操作简单,能耗较低,而且收率较高,纯度也有所提高,最后IFNα1存在于磷酸盐相中,其中PEG含量仅为0．5％左右,这对后继纯化操作很有利。     

海胆黄多糖SEP对S180的体内抑制作用

研究海胆黄多糖SEP对S180肉瘤的抑制作用及初步机制。MTT法检测SEP对体外培养的S180细胞生长的抑制作用;建立小鼠S180肉瘤模型观察SEP抗肿瘤活性;检测SEP协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用;同时,考察SEP对NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lym-phocyte,CTL)活性的影响;碳粒廓清检测SEP对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响。研究表明,海胆黄多糖SEP高中低剂量(16、8、4 mg/kg)显著抑制小鼠180实体瘤生长,增加小鼠脾指数和胸腺指数,协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,提高小鼠NK细胞和CTL活性,增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能,通过免疫调节提高小鼠免疫功能达到抑制S180作用。     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

Ca~(2+)参与水霉菌丝细胞壁修饰的证据

以细胞壁崩溃酶－Driselase短时间处理水霉（Saprolegniaferax）菌丝,pH5．0时可使原生质从菌丝亚顶端喷出,pH6．0～8．0时则不导致该现象发生;适当浓度EGTA的存在,可提高pH5．0时酶解引起的原生质喷出频率、使pH6．0～8．0时生长菌丝的顶端原生质也喷出、并且喷出多发生在菌丝最顶端。外加CaCl2不抑制菌丝顶端原生质的喷出,排除了Ca2+抑制酶活性的可能。随后的跟踪观察显示,长时间以缺Ca2+培养介质培养菌丝,同样能够导致菌丝顶端原生质喷出。上述研究结果表明,培养介质中Ca2+和H+对菌丝完整性的维持起调节作用,细胞壁上的Ca2+可能参与了水霉菌丝细胞壁物理特性的修饰。     

西伯利亚蝗气门结构及呼吸代谢对高温胁迫的响应

【目的】掌握西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus的气门结构和呼吸代谢应对高温胁迫的响应策略。【方法】运用扫描电镜观察西伯利亚蝗气门超显微结构,多通道昆虫呼吸仪测定18~42℃处理下西伯利亚蝗的O_2吸收率、CO_2释放率、代谢率和呼吸商。【结果】西伯利亚蝗共有10对气门,胸部2对,腹部8对,呈圆形或椭圆形,内侧着生有筛板,呈刺凸状,分布密集。18~42℃范围内,随温度升高,西伯利亚蝗呼吸代谢呈先上升后下降的趋势。18℃时西伯利亚蝗雌雄成虫的O_2吸收率、CO_2释放率和代谢率值显著小于其他温度下的相应值(P<0.05),雌虫分别为0.0022 m L/min、0.0019 m L/min和0.0210 m L/(g·min),雄虫分别为0.0016 m L/min、0.0016 m L/min和0.0236 m L/(g·min);21~27℃范围内,西伯利亚蝗雌雄成虫的呼吸代谢变化平稳,超过30℃呼吸代谢各指标值迅速上升,至36℃时雌雄成虫的O_2吸收率和代谢率值均显著大于其他温度下的相应值(P<0.05);雌虫分别为0.0071 m L/min和0.0592 m L/(g·min),雄虫分别为0.0089 m L/min和0.1108 m L/(g·min),39℃时CO_2释放率显著大于其他温度下的相应值(P<0.05),雌雄成虫分别为0.0074 m L/min和0.0067 m L/min。【结论】依据西伯利亚蝗呼吸代谢随温度变化特征可以判断,随气候持续变暖,西伯利亚蝗仍将是新疆高山、亚高山草原的重要致灾类群。