昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化

昆虫表达系统作为一类应用广泛的真核表达系统 ,具有与多数高等真核生物相类似的翻译后修饰的过程。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链 ,难以生成复杂构型糖链成为该系统的缺陷之一。综述了目前昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化研究进展。     

酿酒酵母生物合成胞磷胆碱的条件优化

通过优化胞磷胆碱底物浓度的发酵条件,提高酿酒酵母发酵菌浓及胞磷胆碱转化率.分别以胞苷酸、磷酸胆碱、硫酸镁和乙醇等底物和反应关联物质诱导酿酒酵母,采用单因素变量实验优化发酵条件.优化后,酿酒酵母C401菌株摇瓶培养的菌浓为70 g/L,胞磷胆碱转化率为53.3％,比诱导前提高了33.5％.30 L发酵中菌浓可达90.5 g/L,胞磷胆碱转化率为59％.     

培养介质pH和EGTA对水霉(Saprolegnia ferax)菌丝细胞肌动蛋白的分布与结构的影响

菌丝在pH 5.0—8.0介质中维持顶端生长,Rhodamin-phalloidin荧光探针显示在菌丝顶端都存在F-actin的“帽子”结构;加入EGTA到培养介质中不影响菌丝的顶端生长和actin的“帽子”结构。值得注意的是:菌丝的Rhodamin-phalloidin荧光强度大小与菌丝顶端生长速率成正比;在含有或不含有EGTA的pH5.0培养条件下,菌丝的生长速率均很低,且后部颗粒状的荧光斑点消失;在pH 3.0-4.0培养介质中菌丝生长停止,不但F-actin“帽子”结构消失,整个菌丝荧光也变得非常微弱无法观察,提示酸性pH可引起F-actin的解聚,从而导致生长速率下降甚至生长停止。     

酿酒酵母单倍体菌株分离筛选及其产腺苷甲硫氨酸的初步研究

获得产腺苷甲硫氨酸的二倍体酿酒酵母CGMCC 2842遗传育种单倍体亲本。采用不同产孢培养基考察了酿酒酵母的产孢率,并对酿酒酵母CGMCC 2842进行了生孢培养分离子囊孢子得到单倍体菌株,确定单倍体配型,测定不同单倍体菌株腺苷甲硫氨酸含量。从分离的七株单倍体菌株(6株a型和1株α型)中筛选出一株产腺苷甲硫氨酸较高的a配型的单倍体菌株,经250 m L摇瓶发酵48 h后产腺苷甲硫氨酸1.10 g/L。筛选得到了一株产腺苷甲硫氨酸较高a型的单倍体菌株,为菌株的进一步遗传育种改良和腺苷甲硫氨酸微生物发酵法规模化生产奠定了基础。     

人疱疹病毒7型pp85重组表达及抗体制备

目的 制备人疱疹病毒7型(HHV-7)pp85蛋白及其抗体。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法自HHV-7型YY5分离株中扩增出pp85基因,经测序后构建原核表达质粒PGEX-6p-1+pp85b。重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,诱导蛋白表达。应用酶切鉴定、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性。表达的蛋白经亲和层析纯化后,免疫动物制备多克隆抗体,并通过免疫荧光法鉴定抗体的特异性。结果 成功地获得了高纯度的pp85融合蛋白,纯度可达90%以上;免疫动物后制备的多克隆抗体效价可达1∶102400,该抗体能特异识别HHV-7抗原,而不与HHV-6反应。结论 获得高纯度的HHV-7pp85融合蛋白及其高效价的抗体,将进一步应用于临床检验。     

Ca2+参与水霉菌丝细胞壁修饰的证据

以细胞壁崩溃酶-Driselflse短时间处理水霉(Saprozegma ferax)菌丝,pH5．0时可使原生质从菌丝亚顶端喷出,pH6．0～8．0时则不导致该现象发生;适当浓度EGTA的存在,可提高pH5．0时酶解引起的原生质喷出频率、使pH6．0～8．0时生长菌丝的顶端原生质也喷出、并且喷出多发生在菌丝最顶端;外加CaCl₂．不抑制菌丝顶端原生质的喷出,排除了Ca²⁺抑制酶活性的可能。随后的跟踪观察显示,长时间以缺Ca²⁺培养介质培养菌丝,同样能够导致菌丝顶端原生质喷出。上述研究结果表明,培养介质中Ca²⁺和H⁺对菌丝完整性的维持起调节作用,细胞壁上的Ca²⁺可能参与了水霉菌丝细胞壁物理特性的修饰。     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）突变株EAMZ1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶(Upase)。经测定这种Upase的分子量为12.8×104,亚基分子量为4.3×10.4,由３个同型亚基组成。N端氨基酸序列为：MRMVDLIATKRDGGE。等电点为4.46。对尿苷的Km为0.29mmol/L。酶反应的最适pH为7.8,最适温度为50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5氟尿苷、2′脱氧5氟尿苷及尿嘧啶βD阿拉伯呋喃糖,且具有较高的转移酶活性,能将尿苷和5氟尿嘧啶转化成5氟尿苷(一种抗癌药物的中间体),其转化率为47％。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

海胆黄多糖SEP对S180的体内抑制作用

研究海胆黄多糖SEP对S180肉瘤的抑制作用及初步机制。MTT法检测SEP对体外培养的S180细胞生长的抑制作用;建立小鼠S180肉瘤模型观察SEP抗肿瘤活性;检测SEP协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用;同时,考察SEP对NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lym-phocyte,CTL)活性的影响;碳粒廓清检测SEP对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响。研究表明,海胆黄多糖SEP高中低剂量(16、8、4 mg/kg)显著抑制小鼠180实体瘤生长,增加小鼠脾指数和胸腺指数,协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,提高小鼠NK细胞和CTL活性,增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能,通过免疫调节提高小鼠免疫功能达到抑制S180作用。     

藏红花凝集素分子化学修饰与其活性的关系

对甘露糖专一性结合藏红花凝集素 (Crocussativuslectin ,CSL)分子进行化学修饰 ,测定酿酒酵母 (S .cerevisiae)凝集活性和寡糖专一性结合活性的变化 .实验结果表明 ,Cys的修饰与活性无关 ,Arg、Tyr和His的修饰降低了CSL分子的酵母凝集活性和寡糖结合活性 ,但对CSL的CD光谱无显著影响 ,表明其为凝集素的活性氨基酸残基 .Glu和Asp的化学修饰可使CSL的凝集活性大幅度降低 ,与特异性寡糖的亲和力增大 ,CD光谱变化明显 ,提示CSL分子中的Glu和Asp对其空间结构影响较大 ,氨基酸羧基的修饰导致CSL构象改变 ,蛋白与寡糖的结合位点暴露 ,可有效结合的位点数增加