基于PKS和NRPS基因的海洋来源抗病原菌活性菌株筛选及其代谢产物活性分析

基于聚酮合成酶基因(polyketide synthases gene,PKS)和非核糖体多肽合成酶基因(non ribosomal polypeptide synthase gene,NRPS),本研究从77株分离于北冰洋海泥的菌株中筛选出1株具有较高抗病原菌活性的菌株并对其进行了菌种鉴定。通过优化培养基组成和发酵条件提高了该菌株活性代谢产物的产量,并利用高分辨率质谱(high resolution mass spectrometry,HRMS)、核磁氢谱(¹H nuclear magnetic hydrogen,¹H NMR)和碳谱(¹³C NMR)对其主要代谢产物进行了结构鉴定。测定了该菌株主要代谢产物的抗菌谱及代谢产物对黄瓜枯萎病的影响。研究结果表明,该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其对植物具有一定的促生作用。当发酵条件为麦芽糖5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、温度30℃、转速150r/min、发酵时间60h时,该菌株代谢产物的抑菌圈直径由(16.23±0.42)mm提高至(24.42±0.57)mm。菌株代谢产物含有大环内酯类化合物macrolactin A,其对多种病原细菌和真菌具有明显拮抗作用。黄瓜幼苗实验表明,该菌株代谢产物对黄瓜枯萎病具有防护作用,其作为生防菌剂具有一定的开发应用潜力。     

PI3K信号通路通过Skp2、p27调节肝癌细胞的增殖

探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路调节肝癌细胞增殖的机制.用LY294002特异性阻断PI3K信号通路后,人肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖明显被抑制.RT-PCR及蛋白质印迹结果显示,LY294002增加了p27蛋白的表达,但不影响p27的mRNA表达.在LY294002处理的细胞中转入p27的RNAi质粒以干扰p27蛋白的表达后,肝癌细胞的增殖能力可部分恢复.放线菌酮(Chx)处理实验表明,阻断PI3K信号通路使p27蛋白的半衰期延长,稳定性增加.进一步研究发现,LY294002可抑制介导p27蛋白降解的关键分子Skp2的mRNA表达,还可缩短Skp2蛋白的半衰期,降低Skp2蛋白的稳定性.但在SMMC-7721中分别转染PI3K下游重要靶分子Akt的持续激活和失活突变体,却并不影响p27蛋白的表达.这些结果表明,PI3K信号通路在转录及翻译后水平调节Skp2的表达而影响p27蛋白的降解,从而调节肝癌细胞的增殖,但Akt并没有参与这种调节.     

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ过表达对人肝癌细胞粘着斑复合物介导的信号转导作用

为了探讨过表达N 乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ (GnT Ⅴ )后 772 1细胞侵袭、迁移等行为改变的机制 ,检测了GnT Ⅴ 772 1及pcDNA3 772 1两组细胞中与恶性表型密切相关的粘着斑激酶 (focalad hesionkinase ,FAK)、PTEN蛋白、蛋白激酶B(PKB)等重要信号分子的表达水平 ,同时测定了 2组细胞非贴壁依赖生长的能力 .利用Western印迹方法检测FAK、PTEN、PKB的表达或磷酸化水平 .利用poly hema使细胞非贴壁生长 ,2组细胞悬浮无血清培养 2 0h ,采用流式细胞仪方法检测细胞的失巢凋亡 (anoikis) .研究发现 ,转染GnT Ⅴ后的肝癌细胞的FAK表达无明显变化 ,FAK的酪氨酸磷酸化水平增高 70 %;而PTEN的表达下降了 4 9%;PKB的磷酸化增加 2 0 0 %;pcDNA3 772 1细胞已有明显凋亡 ,而转染GnT Ⅴ的 772 1细胞未发生凋亡 .结果提示 ,转染GnT Ⅴ后的肝癌细胞迁移力增强 ,可能与其FAK的磷酸化程度升高 ,激酶活力增强有关 ;而能逃逸失巢凋亡是因为PTEN的表达下降 ,PTEN蛋白的磷酸酶活性降低 ,细胞Akt PKB磷酸化水平保持在较高水平 .     

糖蛋白折叠质量的监控机制

内质网是一种重要的真核细胞器,糖蛋白的糖基化开始于其中.在内质网中永久性折叠错误糖蛋白或幼稚型糖链糖蛋白,以及突变的糖蛋白被阻止进入高尔基体,而是选择性地被运到胞质,然后在蛋白酶体中被降解.至少两大分子伴侣家族结合蛋白（BiP）和钙联结蛋白（CNX）/钙网蛋白（CRT）参与了糖蛋白折叠的质量控制过程.     

生物钟与衰老的相关研究进展

众所周知,从单细胞生物到人,几乎所有生物体在生理和行为上都表现出昼夜节律.内源性生物钟是产生昼夜节律的物质基础,由母钟和子钟组成,母钟位于下丘脑视交叉上核(SCN),子钟位于各个外周组织(肝脏、心脏等).随着机体的逐渐衰老,反应生物钟输出信号的生理昼夜节律在振荡幅度、振荡周期和表达时相等方面发生了相应的变化.另一方面,生物钟控制的生理昼夜节律影响衰老的进程,生物钟功能紊乱会严重加速机体的衰老.本文概述了衰老与生物钟之间的相关研究进展,为进一步认识衰老机制及其对机体的影响提供了线索.     

金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型的构建与功能评价

【背景】抗生素的无序使用加剧了耐药性金黄色葡萄球菌超级菌株的出现,由其引发的感染已成为最难解决的感染性疾患。在生物体系外构建AgrA/C双组分系统的跨膜信号转导过程,对解决金黄色葡萄球菌的耐药性问题和发现新型抗菌药物具有重要的研究意义。【目的】人工模拟构建金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,为生物体外研究金黄色葡萄球菌双组分信号转导的机制及以其为靶点的药物筛选提供新途径。【方法】在大肠杆菌宿主细胞中大量表达AgrA和Agr C蛋白,利用亲和层析和分子筛凝胶层析对其进行分离纯化,利用非放射性凝胶阻滞实验(EMSA)检测AgrA蛋白活性,并检测Agr C激酶活性;进而利用脂质体介导法在体外组装AgrA/C双组分信号转导模型,应用EMSA方法进行评价。【结果】分离纯化得到AgrA和Agr C蛋白,二者纯度均达到90%以上,均具有活性。在生物体系外构建了金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,该系统可增强AgrA对DNA的延滞作用,具有信号传递功能。【结论】初步构建AgrA/C双组分信号转导模型,该模型具有信号传递能力,有望作为针对金黄色葡萄球菌开发新型抗菌药物的筛选平台。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

2018年8月我国发现非洲猪瘟(African swine fever,ASF),并在多地蔓延,由于尚无疫苗和有效的治疗方法,病死率高达100%,给养猪业带来巨大的损失。目前控制该病,主要依靠快速、准确的诊断方法,尽早发现、处理,防止扩散。为制备特异性的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白单克隆抗体,本研究利用大肠杆菌表达ASFV p54蛋白C端胞内区片段,构建能表达ASFV p54蛋白的工程菌E.coli BL21/pET-p54,经IPTG诱导表达可溶性的p54蛋白。用纯化后的可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经4次筛选和3次亚克隆获得了21株分泌ASFV p54蛋白单克隆抗体的细胞株。通过ELISA测定腹水效价,结果均在1︰40 000～1︰5 120 000范围之内。以免疫组织化学染色法鉴定单克隆抗体,结果有9株可以特异性检出ASFV抗原。对免疫组化阳性的单克隆抗体进行亚类鉴定,结果 5株为IgG1,4株为IgG2a。以免疫印迹试验(Western Blot)和间接免疫荧光法(Indirect ...     

人工抗原合成研究进展

近年来,以小分子化合物为半抗原的免疫分析技术在食品药品、环境保护等领域已有诸多应用,并取得了较为理想的检测效果。小分子化合物只能与载体偶联形成人工抗原后,方能借助T细胞表位间接诱导B细胞进行增殖与分化,进而产生特异性抗体。高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键,就近年来国内外有关人工抗原合成过程中所涉及的小分子半抗原的设计与合成方法、载体的选择、半抗原与载体的偶联方法、人工抗原的纯化及鉴定方法等进行综述。     

解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统ComX信息素前体肽的合成研究

采用Fmoc固相合成法合成了解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统Com X信息素的前体五肽。利用反向半制备色谱(RP-HPLC)和液质联用仪(LC-MS)对合成的五肽进行了分离纯化及纯度分析。建立了检测游离氨基酸的新方法,并详细考察了合成条件对树脂上肽链连接效率的影响。结果表明,新型NNA试剂(茚三酮+正丁醇+乙酸溶液)可替代传统的Kaiser试剂用于Fmoc固相合成中游离氨基的检测;在35℃下,使用DCM和DMF对树脂交替溶胀1h后,树脂上肽链的连接效率最高。合成的Com X信息素前体五肽粗品产率为98%,纯度为58.60%;经半制备型高效液相纯化后,纯度达99%。抑菌实验表明,Com X信息素前体五肽具有明显的生物活性。     

N—乙酰氨基葡萄糖转移酶—V过表达对人肝癌细胞迁移及粘附分子表达的影响

The purpose of this paper is to study the effect of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) overexpression on the migration of 7721 cells and its mechanism. The abilities of migration of both 7721 cells transfected with GnT-V cDNA and 7721 cells transfected with pcDNA3 was detected, the expressions of integrin and E-cadherin which are important adhesion molecules on surface membrane and closely related to the abilities of invasion and metastasis. Cell migration abilities were measured by the agarose drop explant method. Flow cytometric analysis (FACS) was applied to determine the relative amounts of integrin alpha 5 and beta 1 subunits on the cell surface while RTPCR was carried out to determine the expression of their mRNA. The expression of E-cadherin was examined by the immunocytochemical ABC method. Western blot analysis was carried out to examine the expression of beta-catenin. GnT-V overexpression enhanced evidently the migration ability of 7721 cells and increased the amount of integrin alpha 5 subunit to 2.9 times of that of control while the amount of beta 1 subunits was not significantly changed. Besides, the expressions of E-cadherin and beta-catenin were enhanced at different levels in GnT-V/7721 cells compared with mocked. The results suggested that the overexpression of GnT-V related to the production of N-linked sugar chains could promote the expressions of integrin, E-cadherin and beta-catenin on 7721 cells so that the migration ability of tumor cells was enhanced.