λ噬菌体PL启动子控制的乙型肝炎病毒核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

从DMM206,pPLa2311构威杂交质粒pMM-HBC83,使乙型肝炎病毒核心抗原基因在PL启动于控制下,在大肠杆菌中能高效表达,对数生长期细菌合成核心抗原的能力较静止期高,诱导前更换新鲜培养基能提高产置。     

用基于"Neo/E"的技术构建重组质粒

根据重组工程原理,建立了一种用于构建重组质粒的“neo／E”(抗生素／单酶切位点)选择与反选择新方法。首先采用PCR方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组,(1)neo／E基因敲入,重组子呈现neo抗性表型;(2)目的基因替换M／E基因。用限制酶E消化时,发生第二步重组的DNA分子不能被消化,能够转化大肠杆菌受体菌DH5α。应用该方法构建了重组质粒pGL3-Basic PC1900T。PCR及测序鉴定证明：外源片段重组率为20％,所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。     

小鼠PC-1蛋白兔多克隆抗体的制备及初步应用

目的:获得小鼠PC1蛋白的兔多克隆抗体,检测其在小鼠器官中的表达谱。方法:以纯化后的小鼠PC1蛋白及其N端45个氨基酸与GST的融合蛋白(GSTMPC1、GSTMPC145)为抗原,制备了它们的兔多克隆抗体。进一步应用饱和硫酸铵沉淀法、DEAE52和ProteinA亲和层析法对这两个抗体进行了纯化,Westernblot检测了PC1蛋白在昆明白小鼠七个组织中的表达情况。结果:两个兔多克隆血清的效价分别为1∶20000和1∶200000,并能与人工合成的人PC1蛋白N端的46个氨基酸发生良好的交叉反应。PC1蛋白在结肠中有表达,在肾中有微弱表达,而在心、肺、肝、胃、脾中没有表达。结论:获得小鼠PC1蛋白的兔多克隆抗体,PC1蛋白在结肠中有表达,在肾中有微弱表达,而在心、肺、肝、胃、脾中没有表达 。     

腺病毒疫苗研究进展

腺病毒本身作为疫苗和作为抗原呈递载体都是疫苗研究的热点。我们对国内外腺病毒疫苗的研究现状进行了简要综述,对应用腺病毒作为抗原和表位呈递载体的主要设计和研究思路及最新进展做了总结分析。     

pBR322-Red介导的E．Coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,Kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ, lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株：CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。     

p53负调控前列腺癌细胞中PC-1基因的表达

在前列腺癌进展中发生的PC-1基因表达失调和p53基因突变,提示这两个事件之间可能存在的联系.用依托泊苷处理前列腺癌LNCaP细胞后,PC-1蛋白的表达受抑制;瞬时转染分析表明野生型p53负调控PC-1启动子的转录活性;缺失突变分析将PC-1基因启动子上受p53负调控的区域定位在翻译起始位点上游757 bp～323 bp之间.缺失PC-1启动子上的雄激素受体反应元件并没有消除p53对其转录活性的抑制作用;无论p53是否存在,组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理LNCaP细胞后可以导致PC-1启动子转录活性升高.因此,p53和去乙酰化酶可以独立抑制PC-1启动子活性.这些研究结果表明,野生型p53负调控PC-1基因启动子的转录活性,而前列腺癌进展过程中p53突变可能和PC-1基因的表达失调有关.     

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

目的:对真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,以简化目的基因克隆的步骤。方法:用事先设计好的2条寡核苷酸链互相退火,替换pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中NotⅠ与HindⅢ间的部分;利用改构的真核表达载体,分别构建亲环蛋白A、胆绿素还原酶B和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体,瞬时转染293T细胞后,用His标签抗体验证其表达。结果:测序结果证实已将预想的序列替换至pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中相应位置,改构为质粒pcDNA3.1(-)reconstruct;利用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论:改构的真核表达载体pcDNA3.1(-)reconstruct可以简化融合myc和His标签的目的基因克隆的过程,并且增加了限制性位点的可选择性。     

重组酶Exo的纯化及多克隆抗体制备

目的:纯化Exo重组酶融合蛋白并制备相应抗体。方法:用阴离子交换柱对蛋白进行初步纯化,然后用Ni-NTA介质填充的层析柱分离纯化含His标签的融合蛋白,用谷胱甘肽琼脂糖4B介质填充的层析柱分离纯化GST融合蛋白;二次纯化的蛋白利用硝酸纤维素膜结合法制备抗原蛋白并免疫实验动物。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶12 800,说明通过Western免疫印迹自制的多克隆抗体能特异地与Exo重组蛋白相互作用。结论:该蛋白纯化方法操作简单,制备的抗原纯度高,多克隆抗体特异性好。     

鼠mPC-1基因的克隆与特性分析

为深入研究人前列腺癌相关基因PC-1的生物功能和进化保守状况,从小鼠肾脏中克隆了全长cDNA序列,命名为mPC-1（GenBank Acc No.AY048852）.mPC-1基因cDNA全长为2 193 bp,主要定位于小鼠染色体3A1-A2区域.mPC-1基因最大开放阅读框编码的蛋白质由224个氨基酸组成,与人PC-1蛋白编码区存在82%的序列一致性,含有coiled-coil结构域和PEST结构域.生物信息学分析表明,由6个外显子组成的mPC-1基因与mD52高度同源,其中,第一外显子代表该基因的特异性序列,实验证据显示mPC-1基因具有自己的启动子,推测mPC-1与小鼠mD52可能是重叠基因.对小鼠20种组织器官和不同发育阶段的胚胎组织cDNA的RT-PCR检测证实,该基因主要在前列腺、肾和眼组织中表达,在胃和平滑肌中有少量表达,在其他组织中表达很弱或不表达.而mD52基因则几乎广泛存在于小鼠的各个组织器官中,因此,两个基因虽然序列上高度重叠却是独立调控的.综上所述,mPC-1基因可能是一个与人PC-1基因结构功能类似的新基因.     

pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用

pBR32 2 - Red是一种新型重组工程系统 ,它携带了λ-噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件。对pBR32 2 Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能 ,在菌株W3110体内 ,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰 ,包括 :①运用kan-sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacI,②运用kan -sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置 ,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况。结果表明运用不同的重组策略 ,pBR32 2- Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰。