人血管内皮生长因子功能域受体的筛选及其生物学活性研究

利用PCR技术,从人胎盘cDNA文库扩增出4个截短的人血管内皮生长因子受体(Flt-1)cDNA,分别含胞外第2,1-2,2-3,1-3个loop,应用酵母双杂交系统对Flt-1的最小配体结合域进行了研究,结果表明,不仅其胞外1-3loop能与hVEGF₁₆₅结合,比其更小的片段2-3loop也具有与配体结合的能力.进一步构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3)和pPIC9K/Flt-1(2-3),转化Pichia pastoris酵母菌GS115,摇瓶培养,经1%甲醇诱导,表达的Flt-1以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4 d的表达量占上清总蛋白质的60%以上.表达产物经CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析纯化,纯度达90%以上.体外生物学活性检测表明,表达的可溶性Flt-1(2-3)具有与Flt-1(1-3)接近的结合hVEGF₁₆₅的能力和抑制hVEGF₁₆₅对HUVEC的促增殖功能.进一步的动物模型实验证实,可溶性Flt-1(2-3)具有显著的抑制hVEGF₁₆₅促进新生血管形成的功能.     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

Screening of human vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 domain and study on its biological activity

Four human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 cDNA fragments containing extracellular domain loops 2, 1-2, 2-3 and 1-3 respectively were amplified from human placen-tal cDNA library by PCR and used for screening ligand binding domains by yeast two-hybrid system. The result showed that, not only loop 1-3, but also the smaller fragment loop 2-3 could bind to hVEGF165. Recombinant expression plasmids pPIC9K/Flt-1(1-3) and pPIC9K/Flt-1 (2-3) were constructed and transformed to Pichia. pastoris host strain GS115, cultured in flasks, and expressed under the induction of 1 % methanol. The expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecules and contained more than 60% of total protein after being induced for 4d. After being purified by CM-Sepharose FF and Sephacryl S-100 chromatography, its purity reached above 90%. Biological assay in vitro showed that the binding capacity of expressed soluble Flt-1 (2-3) to hVEGF165 and its inhibiting effect on the proliferation of human um     

荧光相关光谱在生物化学领域中的应用

荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一种通过监测荧光涨落从而获得单分子水平的分子扩散行为信息的技术。FCS高灵敏度的优点使得它已发展成为一种可以在活体外与活体内检测分子浓度、扩散系数、结合和解离常数等参数的有力工具。荧光互相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)是FCS技术的进一步发展,其大大扩展了FCS技术的应用范围。本文介绍了FCS及其衍生技术的原理及其在生物化学领域的应用。     

硫链丝菌素诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡

自噬在细胞的生命过程中起了非常重要的作用,它能通过清除受损的细胞器和过多的蛋白质以维持细胞内环境稳定基本能量代谢的稳定。然而,自噬的持续激活可导致细胞器以及必需的蛋白质的过度消耗,导致不依赖caspase的自噬性细胞死亡。因此,通过这种自噬途径诱导细胞死亡可能是癌症治疗的一种新方法。在本研究我们发现,硫链丝菌素能够减少非小细胞肺癌PC-9细胞的细胞活力和诱导细胞凋亡。另外,我们发现硫链丝菌素诱导了PC-9细胞自噬。此外,我们也发现硫链丝菌素诱导的细胞凋亡可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻止。这些结果表明,硫链丝菌素促进人体非小细胞肺癌细胞的自噬性死亡。在本研究我们的发现也提示硫链丝菌素联合自噬诱导剂可能在临床上对治疗人非小细胞肺癌有效。     

超干处理对胡杨种子抗逆生理生化指标的影响

以珍稀濒危植物胡杨种子为材料,采用硅胶脱水的方法制备不同含水量的种子,再经不同相对湿度的溶液对种子进行回湿处理,确定最适含水量及最适回湿方法;对最适含水量种子进行50℃高温老化处理,经回湿后测定各种酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛含量,考察超干保存的效果,明确超干保存胡杨种子的可行性。结果表明:(1)当胡杨种子含水量降至3.4%时,其发芽率开始显著下降,但经回湿处理后的发芽率和发芽指数可恢复至未经超干处理样品的水平。(2)采用4种不同的方法对含水量为3.4%的种子进行回湿处理,各回湿方法处理的种子发芽率和发芽指数均显著高于未回湿处理,并以先用饱和CaCl2回湿12h后再用饱和NH4Cl回湿12h的处理效果最佳。(3)在50℃高温老化处理过程中,超干处理(含水量为3.4%)和未超干处理的胡杨种子过氧化物酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性以及可溶性糖的含量均逐渐降低,而丙二醛的含量则逐渐升高,但超干处理种子的升降幅度明显较小。研究认为,胡杨种子超干处理的最适含水量为3.4%,超干处理种子较适宜的回湿方法是饱和CaCl2和饱和NH4Cl依次回湿处理各12h,超干处理可使胡杨种子抗氧化酶活性和可溶性糖含量于老化过程中维持在相对较高水平,膜系统伤害较轻,从而提高种子的抗老化能力,说明超干保存胡杨种子具有一定的可行性。     

三叶木通茎藤及果实性状评价研究

根据湖南、湖北两省野生三叶木通9个茎藤及果实性状的广义方差及主成分分析结果,探讨了三叶木通种源质量及优良品种茎藤、果实性状的选择重点。广义方差分析结果表明：湖北省鹤峰产地的野生三叶木通,9个茎藤及果实性状综合评价为最好,其次是湖北省宜昌、湖南省石门、永定、慈利产地的三叶木通。主成分分析结果表明：在三叶木通优良品种茎藤及果实性状选择中,果皮厚度、单果重、籽重、果皮重及茎藤纹理为第一主成分要素,为首选性状;果实容重、茎藤容重、茎藤色泽及果皮率为第二主成分要素,为比较重要的选择性状;适当注重较深茎藤色泽性状的选择,有可能尽量减少果实容重下降。所以,三叶木通茎藤及果实性状的选择,可以考虑3个主选性状：茎藤纹理及单果重为主体的果实性状、茎藤色泽性状和茎藤容重性状。