肺癌患者血浆外泌体蛋白质组分析

目的:探究肺癌患者与肺部良性结节病人血浆外泌体中蛋白质组的差异。方法:收集肺癌与肺部良性结节病人的术前血浆,随机选取肺腺癌病人血浆15例、肺鳞癌病人血浆10例作为实验组,肺部良性结节病人血浆5例作为对照组,采用超速离心法分离得到外泌体,定量质谱鉴定分析肺癌病人与肺部良性结节病人血浆外泌体蛋白质表达的差异性,SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检验提取到的蛋白质。结果:共检测到血浆外泌体蛋白质253个,并初步确定其中18个在肺癌病人血浆外泌体中表达上调,8个在肺癌病人血浆外泌体中表达下调,免疫印迹法验证了上调蛋白质中的补体蛋白C4a。结论:鉴定出26个外泌体差异表达蛋白质,为肺癌早期诊断提供了新的候选分子。     

t-PA突变体山羊乳腺表达载体构建及转染细胞的核移植试验

构建了t-PA突变体山羊乳腺特异表达载体pGBCt-PAm,包括长4．1kb的山羊β-酪蛋白启动子以及启动子前2．4kb的鸡β-珠蛋白绝缘子序列;并检测了表达载体在家兔乳腺的瞬间表达,验证了载体的有效性。通过电击和脂质体2种转染方式转染了山羊胎儿成纤维细胞(GFFC),经过筛选检测,得到了7株能大量扩增的PCR阳性细胞株。其中的2株(M9,M10)已经进行了首次细胞核移植和胚胎移植试验,2只受体羊2个情期未见返情。     

连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达。方法:采用连续3步缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3’端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9kb的mWAP基因5’端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。     

肿瘤细胞外泌体中融合基因的检测

目的:探究肿瘤细胞分泌的外泌体中是否可以检测到来源于源细胞的融合基因m RNA。方法:培养人非小细胞肺癌NCI-H3122细胞,采用外泌体试剂盒提取细胞上清中的外泌体,并用Western Blot实验验证外泌体是否提取成功。分别提取外泌体以及H3122细胞中的总RNA,将RNA反转录为c DNA,通过PCR反应扩增v1型EML4-ALK融合基因片段,经琼脂糖凝胶电泳确定目的条带后,将两种PCR产物送公司进行基因测序,最后对测序结果进行比对分析。结果:从H3122细胞上清中成功提取了外泌体,并且在外泌体中检测到来源于H3122细胞的m RNA;从H3122细胞外泌体中检测到EML4-ALK融合基因,并发现外泌体中的EML4-ALK融合基因的融合形式为V1,与在H3122细胞中检测到的EML4-ALK融合基因的融合形式完全相同。结论:肿瘤细胞分泌的外泌体中可以检测到肿瘤细胞来源的m RNA,并且外泌体中的m RNA可以反映肿瘤细胞m RNA的基因融合情况等生物学特性。     

表达乙肝病毒受体人ASGPR转基因小鼠的建立

目的：建立表达乙肝病毒受体人ASGPR的转基因小鼠。方法：克隆人的脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）两个亚基的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微共注射的方法将两种各3.9kb的转基因片段引入小鼠的受精卵。采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹的方法对转基因小鼠进行鉴定。结果与结论：获得了在小鼠肝脏组织中共表达有乙肝病毒（HBV）受体ASGPR H1和ASGPR H2的一个转基因小鼠系,可为HBV的研究提供一种良好的感染动物模型。     

一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法

目的：建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。方法：用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒。结果：与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异。结论：建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因

ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3 PUFAs的含量与ω-6 PUFAs（其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反）相比很低。而对于人体,无论ω-3 PUFAs的过低还是ω-6 PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3 PUFAs含量的途径或者大量生产ω-PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA31-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸（从十八碳到二十二碳）。Ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。Ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。