禽致病性大肠杆菌E058株毒力基因(aerobactin)与sit操纵子基因突变株的构建及其致病性

[目的]探究毒力基因aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株致病作用的相关性.[方法]利用Red同源重组方法,构建APEC E058株aerobactin与sit操纵子基因缺失株E058Δvir,并通过一系列的体内及体外试验对其生物学特性进行研究.[结果]生长曲线测定、细菌侵袭试验及体外竞争等试验结果表明,突变株与亲本株差异不显著;体内动态分布试验结果显示,突变株E058Δvir在5个被检脏器中均极显著地低于亲本株(P＜0.001).[结论]aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株的致病性相关,是其重要的致病因子.     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

将新城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pFG1175-1的P7-5启动子下游,得到转移载体pFG1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SPF试验鸡能产生对NDV强毒攻击的免疫力,保护率达96.3%。     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263～277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263~277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1 A/D/SD/04株HA、NA、NS的全基因表达/转录载体,以及NS的删除突变载体(m248),A/D/YZ/04株的NS基因表达/转录载体(848)和其补加15个核苷酸的NS突变载体(m848)。构建的载体分别与编码WSN(H1N1)内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒:RWSN-848和RWSN-m248在263~277位缺失15个碱基,RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价(HA)、鸡胚的平均死亡时间(MDT)和鸡胚半数感染量(EID50)均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN-m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263~277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。     

超低温冷冻对益智种子生理生化特性的影响

益智(Alpinia oxyphylla)是我国四大南药之一,其种子为顽拗性种子,不耐干燥和低温,无法常规保存。为解决益智种子长期稳定保存的问题,该研究以益智种子为材料,从种子含水量以及冷冻方式方面优化益智种子超低温保存方法,并对比液氮冷冻前后种子发芽率、α-淀粉酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、脱氢酶活性、丙二醛含量等活力指标,分析液氮超低温冷冻对益智种子生理生化特性的影响。结果表明:直接液氮冷冻含水量13.92%~14.38%范围的种子是益智种子超低温保存的最佳条件。液氮冷冻后,随着超低温冷冻时间的延长,益智种子发芽率先由76.76%下降至52.5%,再上升至65%,最后下降并稳定在50%以上。其种子α-淀粉酶活性先下降后上升,然后又下降,最后上升并稳定至冷冻前的水平。丙二醛含量则是先上升后下降,最后趋于平稳状态。过氧化物酶活性是先下降,然后稳定在恒定水平。超氧化物歧化酶活性是随着冷冻时间的延长而持续上升,脱氢酶活性则是持续下降。以上结果说明,液氮冷冻时间对益智活力有一定的影响,但对种子有些性能具有一定的促进作用。无论是发芽率,还是生理生化指标,都不同程度表明液氮超低温保存益智种子是可行的。     

家鸭中H8N4亚型流感病毒株A/duck/Yangzhou/02/2005的全基因克隆和序列分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测,分离鉴定出国内报道的第一株H8亚型禽流感病毒。应用流感病毒通用引物成功地扩增出H8N4亚型禽流感病毒A/duck/Yangzhou/02/2005株(简称Dk/YZ/02/05)的全基因序列。将Dk/YZ/02/05的基因组核苷酸全序列与网上公布的基因序列进行比较分析,结果表明:Dk/YZ/02/05(H8N4)的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框;其推导的血凝素(Heamgglutinin,HA)氨基酸剪切位点序列为P-S-V-E-P-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列;神经氨酸酶(NA)在第48位氨基酸后无20个氨基酸的缺失;非结构蛋白(NS)79~84位也没有氨基酸的缺失。     

抗鸡新城疫病毒单克隆抗体的研制

我们于1984年开始以鸡新城疫病毒(NDV)强毒株F48E8为抗原,研究抗鸡新城疫病毒单克隆抗体,得到两株杂交瘤细胞系:NDV-Hy-23和NDV-Hy-33。经3次克隆后,这两株杂交瘤细胞系均能稳定地分泌高滴度抗鸡新城疫病毒特异抗体,培养上清中McAb的免疫荧光滴度为1:50～1:100,小鼠腹水中Mc-Ab的免疫荧光滴度为1:100,000～1:1,000,000。免疫扩散试验证明:NDV-Hy-23分泌小鼠IgG1型抗     

清酒酵母与酿酒醇母原生质体融合的研究

清酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓａｋｅＹａｂｅ）是日本清酒的生产菌株．耐酒精能力强;Ｋ氏酿酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫ）是酒精生产的常用菌株,发酵力强。本文应用原生质体融合技术进行了二菌株原生质体融合的研究。通过硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变得到营养缺隐型菌株Ｑ（ａｒｇ－）和Ｋ（ｌｙｓ－,ρ－）,其融合率为１．２５×１０－５。检出的融合子其酒精发酵特性、细胞形态、体积大小都不同于双亲菌株。比较了在２８℃培养条件下,出发余株清酒酵母,Ｋ氏酿酒酵母和融合子Ｆ１、Ｆ２的发酵速度曲线、乙醇产量和酒精耐量等,得到一株在２８℃培养条件下,乙醇产量为７．４％（Ｖ／Ｖ）,酒精耐量为１５％的融合株Ｆ１。     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RTPCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P75的下游,得到重组转移载体1175HA。以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wtFPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含Xgal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPVHA。以间接免疫荧光法证实感染rFPVHA的CEF表达了HA。rFPVHA在免疫7日龄SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天。在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPVＨＶ能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株

利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6 2全禽源的重配AIV。将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cD-NA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒。将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72~90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,最终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。