Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。     

超选择性股动脉内骨髓单个核细胞移植治疗股骨头坏死187例

目的 研究自体骨髓单个核细胞移植对股骨头坏死患者缺血状态的改善程度和治疗效果.方法 选取2004 年7 月至2010 年11 月期间187 例252 髋股骨头坏死患者,应用自体骨髓单个核细胞移植治疗,分别采集 187 例患者骨髓200 -360 ml,采用 Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞,单个核细胞总数为（2.4 ~ 7.8）× 108 个,流式细胞仪检测 CD34＋ 细胞和 CD133＋ 细胞在所分离出的干细胞悬液中的含量分别为2.47﹪± 0.58﹪和1.29﹪± 0.35﹪,然后将单个核细胞用生理盐水制备成细胞悬液 20 - 30 ml,使用数字减影血管造影技术（DSA）行超选择性股骨头供血动脉内干细胞移植术.按世界骨循环研究学会（ARCO）对骨坏死分期,设自身前后对照观察疗效.移植术后第 3、6、12、24、36 和48 个月,根据髋关节 Harris 评分评价疗效,移植术后6 个月通过复查患者股骨头供血动脉 DSA,观察其新生血管形成情况,以后每隔 6 个月采用影像学方法观察股骨头形态学变化.结果 （1）临床疗效：对接受自体骨髓单个核细胞移植治疗的187 例患者随访 3 ~ 48（24.2 ± 4.5）个月,其中髋关节疼痛缓解者 158 例（占患者总数的 84.5﹪）,髋关节功能改善者 146 例（占患者总数的 78.1﹪）,行走间距延长者 149 例（占患者总数的 79.7﹪）;（2）影像学检查：干细胞移植术后 6 个月187 例患者中54 例行股骨头供血动脉 DSA 检查,48 例显示供血动脉较移植术前明显增多、增粗,血流速度增快,12 ~ 24个月后 72 例患者股骨头区骨质病变获得改善.结论 超选择性动脉内骨髓单个核细胞移植方法简便、安全有效,对因缺血导致坏死的股骨头无再次损伤,能够有效治疗缺血性股骨头坏死.     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞分离培养方法研究

为了建立经济实用的神经干细胞培养方法 ,以Wistar大鼠胚龄 1 4～ 1 5天的胚胎为实验材料 ,选取中枢神经系统的大脑和小脑神经组织 ,经 0 1 2 5 %胰酶消化处理 ,在生长因子 (aFGF和bFGF)作用下 ,采用无血清培养法进行培养。通过倒置相差显微镜进行观察 ,可观察到明显的干细胞的不对称分裂图像。神经干细胞在培养一段时间后均出现细胞团 ,细胞团贴壁后可进行分化 ,形态上表现为神经元样和神经胶质样细胞。利用激光扫描共聚焦显微镜对其进行鉴定 ,可检测到神经干细胞标志性蛋白-Nestin蛋白。采用此法可以分离得到具有干细胞特征和多分化潜能的神经干细胞 ,建立了一套神经干细胞的分离、培养和鉴定的方法 ,这将对更好地理解神经系统的发育机制 ,及临床治疗神经系统疾病具有重要意义。     

赤眼蜂生物学与繁殖技术研究及应用——广东省生物资源应用研究所(原广东省昆虫研究所)赤眼蜂研究50年

本文介绍了广东省生物资源应用研究所(原广东省昆虫研究所)50多年来有关赤眼蜂生物学与繁殖技术及应用研究工作。内容包括赤眼蜂种质资源挖掘、寄生生态学、药剂敏感性、滞育贮存和体外培育技术等应用基础研究。研究的赤眼蜂近20种(品系),重点研究了使用范围广的松毛虫赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂、广赤眼蜂以及可用米蛾卵繁殖并对南方水稻、甘蔗和玉米等作物螟虫有较好防控效果的稻螟赤眼蜂、欧洲玉米螟赤眼蜂和亚洲玉米螟赤眼蜂。     

HMGB1对小鼠系膜细胞细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响

该实验以小鼠系膜细胞MMC为研究对象,以重组HMGB1为刺激物,通过检测细胞周期的变化及细胞PCNA、CyclinD1、CDK4和p16的表达水平,初步探讨HMGB1对系膜细胞的细胞周期及其相关调控因子的影响。选取小鼠系膜细胞MMC为研究对象,随机分为对照组及0.05mg/LHMGB1刺激组,经流式细胞术检测发现HMGB1能够上调小鼠系膜细胞中S期细胞所占比例;免疫细胞化学检测显示,PCNA蛋白在小鼠系膜细胞中的表达上调;通过RT-PCR技术及Western blot技术检测到小鼠系膜细胞中CyclinD1 mRNA和蛋白以及CDK4蛋白的高表达情况,而p16蛋白的表达呈时间依赖性降低。由此可见,HMGB1可能是通过上调CyclinD1/CDK4的表达,并下调p16的表达,促进细胞从G_0/G_1期进入S期,介导了小鼠系膜细胞的异常增殖,可能是HMGB1参与狼疮性肾炎发病的可能机制之一。     

三角褐指藻dxs基因克隆与诱导表达

为研究6种外源因素处理对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因表达的影响,通过高通量转录组测序技术获得三角褐指藻dxs基因cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。研究结果表明,三角褐指藻dxs基因cDNA全长2476 bp, ORF全长2193 bp,编码730个氨基酸,具有高度保守的ThDP结合位点和转酮醇酶结构域。三角褐指藻DXS蛋白为亲水性稳定蛋白,相对分子质量(M_w)为79.31 kD,理论等电点为6.65,具有信号肽、跨膜区域、卷曲螺旋和TM-螺旋等。系统进化树分析结果表明, DXS蛋白进化树分为高等植物和藻类2个分支,高等植物DXS蛋白进一步分为DXS1和DXS2两支,藻类DXS蛋白聚类为3个分支,分别为硅藻门、红藻门和绿藻门分支,三角褐指藻聚类在硅藻门分支上。诱导表达调控结果表明,三角褐指藻dxs基因受到茉莉酸甲酯(MeJA)、花生四烯酸(AA)、硫酸铈铵(ACS)、光合诱导素(PIF)、光合抑制剂(DCMU)和光质等6种外源因素的诱导调控。在100μmol/L MeJA...     

珠江三角洲小菜蛾区域性引诱剂的研制及诱集效应研究

小菜蛾Plutella xylostella L.是为害十字花科蔬菜的世界性大害虫。小菜蛾的综合防治技术中,昆虫信息素技术因其安全无污染的特点受到人们的关注,但由于市售性诱剂在不同蔬菜种植区的诱蛾效果存在明显差异,严重制约了该技术的推广和应用。因此,本研究开展珠江三角洲区域针对性小菜蛾引诱剂研制及田间诱集效应的研究。研究结果表明,小菜蛾合成性信息素组分顺-11-十六碳烯醛(Z11-16:Ald),顺-11-十六碳烯乙酸酯(Z11-16:Ac)与顺-11-十六碳烯醇(Z11-16:OH)均能引起小菜蛾雄成虫触角产生电生理反应。田间诱集效应试验表明,小菜蛾合成性信息素组分Z11-16:Ald,Z11-16:Ac和Z11-16:OH在诱芯中比例为30∶70∶0.1,剂量为100.1μg时的田间诱蛾效果最好,与已报道性诱剂配方50∶50以及70∶30∶1相比较,诱蛾效果增加了28%-38.1%和65.1%-66.9%,明显提高了小菜蛾引诱剂的田间诱蛾效果。适用于珠三角地区的区域性小菜蛾引诱剂的研制与应用,有望在小菜蛾地区针对性害虫生态调控技术中发挥重要作用。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

小鼠对表达HBV截短肽的耻垢分枝菌的免疫应答

分别以生理盐水、pcDNA3.1(-)空质粒、重组真核质粒pcDNA3.1(-)-C-preS1(简称基因免疫组)、耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌(简称重组耻垢免疫组)注射BALB/c小鼠,各组均免疫2次,每次间隔3周。末次注射后进行连续抗体测定,最后处死小鼠分离脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验和细胞毒性T细胞杀伤实验。重组耻垢免疫组抗体滴度升高幅度前期低于基因免疫组(P<0.05),后者45 d达到峰值1∶5 100。前者抗体滴度第60 d达到峰值1∶6 900,45 d后重组耻垢免疫组抗体滴度高于基因免疫组(P<0.05),且维持时间较基因免疫组更长(P<0.05)。基因免疫组诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数低于重组耻垢免疫组(P<0.05)。后者诱导的特异性CTL杀伤率最高可达到50.2%,而前者最高为31.6%,二者有显著区别(P<0.05)。     

抗HBV与HCV免疫乳的实验免疫研究

确定重组HBV表面抗原和HCV核心抗原对奶牛的最适免疫剂量、免疫次数及间隔时间,观察牛奶中抗HBV与抗HCV的效价与消长规律。表达HBV表面抗原和HCV核心抗原的重组菌经IPTG诱导后,目的蛋白以包涵体形式存在。放大发酵工艺,菌体发酵密度达40g／L,目的蛋白表达量为26％～30％。将包涵体变性、复性后,测定蛋白含量,并用SDS-PAGE鉴定。采用不同的剂量和不同的抗原处理方法免疫奶山羊和奶牛,检测HBV抗体、HCV抗体、干扰素与白介素等细胞因子。免疫奶山羊羊奶中的HBV抗体效价最高为1：80,HCV抗体效价最高为1：20;6个月后,HBV抗体效价无明显下降,HCV抗体效价下降明显。对奶牛5个批次的免疫结果显示,免疫次数应多于3次,免疫剂量以每头牛300μg为宜,间隔时间以1个月为宜。免疫牛奶中HBV抗体的阳性率约为66．0％,抗体效价最高为1：160;HCV抗体阳性率约为17．0％,维持时间较短;孕牛比旺奶牛产生抗体的效价高。免疫牛奶中检测到了干扰素和白介素等细胞免疫活性因子。