人胃癌细胞系中P53抑癌基因变异的检测及其序列分析

Ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应－－单链构锡多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中Ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５第第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变,ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２     

提取线粒体DNA方法的比较及较纯线粒体基因获取方法的确立

目的:对2种常用的线粒体DNA提取方法进行比较,分析提取物中核DNA的存在情况,同时建立新检测方法降低线粒体假基因干扰。方法:以仅在核DNA中存在的基因β-actin作为核DNA存在的标定基因,通过PCR方法扩增线粒体DNA上的一段基因MTND5-2,并以β-actin做参比,比较常用的2种提取线粒体DNA方法的优劣,即碱法Ⅰ(先提取完整线粒体后从中获得线粒体DNA)和碱法Ⅱ(根据线粒体DNA与核DNA的结构差异,从中获得双链环状的线粒体DNA)。结果:2种线粒体DNA提取方法并不能获得仅含线粒体DNA的纯提取物,碱法Ⅰ获得的线粒体DNA纯度相对较高;以碱法Ⅰ提取物为模板进行PCR,可获得更多较纯的线粒体目的基因。结论:碱法Ⅰ较碱法Ⅱ可获得更纯的线粒体来源的目的基因;新建方法可获得较纯的线粒体基因,且是一种简单、方便、经济的方法。     

间隙连接蛋白Cx43在人胚肺和肺癌细胞表达的研究

细胞与细胞之间通过细胞膜上的间隙连接通道交换小分子和离子进行细胞间通讯,对细胞增殖分化调控和机体内环境稳定有重要作用。用间隙连接蛋白Ｃｘ４３ｃＤＮＡ探针Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交,Ｃｘ４３抗体免疫荧光染色和罗氏黄荧光染料传输方法检查,正常人胚肺细胞的Ｃｘ４３在ｍＲＮＡ和蛋白水平有高表达,Ｃｘ４３蛋白免疫荧光分布在间隙连接的部位,细胞间隙连接通讯功能明显。与正常相反,人肺癌ＰＧ系细胞Ｃｋ４３无论在ｍＲＮＡ或蛋白质水平都无表达,细胞通讯功能缺陷。结果表明Ｃｘ４３在培养的人胚肺细胞有功能性表达。人肺癌ＰＧ细胞通讯功能缺陷与Ｃｘ４３基因转录抑制有关。对Ｃｘ基因的抑癌基因性质进行讨论。     

人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化细胞基因组文库的构建及其转化基因的克隆

以人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化的鼠成纤维细胞为材料,用λ噬菌体EMBL_3,作克隆载体,构建了转化细胞的基因组文库。用~(32)P标记的人Alu重复顺序和原癌基因c-Ha-ras为探针,对100万基因文库噬斑进行原位杂交筛选,找出了两个可以同时与上述探针杂交的阳性克隆。经对两个阳性克隆DNA进行分子杂交表明,它们均含有来自人胃癌细胞株BGC-823的转化基因Ha-ras,进一步运用质粒载体pBR322对这一转化基因进行次级克隆,并进行了限制性内切酶图谱的初探,从而为研究胃癌转化基因的结构、DNA序列及与原癌基因的异同奠定了基础。     

生长因子受体类癌基因的扩增与胃癌癌变的关系

用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术检查了３２例胃癌组织和４株胃癌细胞系中原癌基因ｍｅｔ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ－２、Ｒａｓ和ｍｙｃ的扩增,发现ｍｅｔ基因扩增６例,ＥＧＦＲ扩增１例、缺失２例,ＡＫＴ－２扩增２例,没有发现Ｒａｓ基因和ｍｙｃ基因的扩增．有癌基因异常的病例多为低分化、临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的个体,提示癌基因扩增是肿瘤发展的晚期事件。     

化学致癌作用靶基因的分离与测序

采用新的差异表达基因显示法,从一对处于不同癌变阶段的人类胃粘膜上皮细胞,显示和分离出了差别表达的基因。其中8个基因片段克隆于质粒DNA,荧光标记测序分析并在基因库中查找比较,发现其中一个基因与人类“真核蛋白合成启动因子”EIF-4γ)97.5％同源,另一个与大鼠SX1基因有86.2％的同源。其余6个为未报道基因序列。由于这对细胞的差别是化学致癌物MNNG所致,这些新分离的基因可能即为化学致癌剂的靶基因,与细胞的癌变相关。     

原癌基因c—met的激活与人类肿瘤发生发展的关系

原癌基因ｃ－ｍｅｔ属于具酪氨酸酶活性的生长因子受体类,编码肝细胞生长因子（ＨＧＦ）受体,是细胞内信息传导的重要组分。ＨＧＦ激活的ｃ－ｍｅｔ受体与细胞内的ＰＬＣγ、Ｇ蛋白,及多种癌基因产物直接作用,是细胞生长、分化的重要调节者。ｃ－ｍｅｔ表达与结构的异常下多种人类肿瘤的发展、发展密切相关。ｃ－ｍｅｔ激活的主要方式是重排、扩增和高表达。不同类型的肿瘤细胞和组织中,ｃ－ｍｅｔ激活的方式不同。对ｃ－ｍｅｔ     

反义RNA对人胃癌细胞生长抑制及恶性表型的阻断作用

ｒａｓ原癌基因的点突变是人胃癌发生发展的重要机理之一。利用能表达ｃ－Ｈ－ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ的质粒,导入人胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３,研究了ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ对人胃癌细胞生长及恶性表型的作用,结果表明,ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ可引起ＢＧＣ－８２３生长速率及形态的变化,在半固体培养基中细胞集落形成能力减弱,部分地抑制了ＢＧＣ－８２３在裸鼠体内的致瘤性。ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ对其ＲＮＡ的过量表达呈特异性抑制作用。     

人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析

ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种肿瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应─—单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５和第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变。ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２８０位、２０４位密码子发生缺失Ｇ,ＧＣ→ＣＧ,ＡＴ→ＣＧ转变,因而可使其编码的ｐ５３蛋白分别发生移码突变,Ａｒｇ→Ｔｈｒ,Ｇｌｕ→Ａｌａ,而丧失肿瘤抑制功能。实验结果表明,ｐ５３基因在胃癌发生发展过程中,尤其是较晚阶段具有重要作用。     

PCR-RFLP 方法测定 ras 癌基因点突变

曾使用 PCR-RFLP 方法分析过 c-Ha-ras 癌基因第12密码子的点突变.因N-ras 基因第12位密码子、K-ras 基因第12和13位密码子无已知的限制性内切酶的酶切位点,不能使用 PCR-RFLP 方法分析这些位点的突变.在 PCR 引物的3′端引入一个误配的碱基使之正好成为某限制性内切酶的酶切位点,这样便能使用PCR-RFLP 技术分析 c-Ha-ras 基因第61位、N-ras 基因第12位、K-ras 基因第12和13位密码子的点突变.