同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累

利用重组毕赤酵母(Richia pastoris)强化表达S-腺苷甲硫氨酸(S-adenvylmethionine,SAM)合成酶(SAM synthetase,SAMS),发酵生产SAM时,胞内SAMS活性和ATP水平是影响SAM合成的重要因素.为了同时保持较高的SAMS活性和ATP供应,我们构建了一株既含有AOX1诱导型表达单元,又含有GAP组成型表达单元的双SAMS表达单元P.pastoris重组菌株Gd.它既能受甲醇调控表达SAMS,又能以甘油为碳源表达SAMS.在培养过程中,先是以甲醇诱导SAMS表达,得到较高的酶活,然后在发酵中后期再将碳源换为甘油.这样不但可以维持较高的酶活,而且可以提高胞内ATP含量.实验结果显示,对于同时利用AOX1和GAP启动子表达SAMS的重组菌,可采取甲醇和甘油两阶段补料,该重组菌的SAMS比产率高于组成型重组茵Xg,Gd进入甘油补料期后胞内ATP含量高于诱导型重组菌Ga.双表达单元菌株Gd的SAM产量达到1.41 g/L,比诱导型表达SAMS的重组菌株提高了76.3%,比组成型表达SAMS的重组菌株提高了60.2%,.     

一种优化的成年斑马鱼视网膜吗啡啉电转染方法

通过吗啡啉(morpholino,MO)电转染敲降斑马鱼视网膜内目标基因表达是研究基因功能的有效手段,但现有方法存在局限性。本文旨在发展一种优化的成年斑马鱼视网膜MO电转染方法。优化要点是在电极内侧涂抹超声凝胶,并使用方形电极而不是圆形电极。结果显示,使用超声凝胶可有效减少电转染所致视网膜损伤并简化实验步骤,采用方形电极显著提高了MO电转染效率。用本方法敲降视网膜再生相关基因Ascl1a显著抑制了视网膜祖细胞的生成。本方法是对现有MO电转染方法的优化。     

石蒜绵粉蚧生物学特性

【目的】石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani是近年来我国大陆新记录的一种有害昆虫,对我国的农业生产和生态环境具有潜在的巨大威胁,而本研究旨在明确该虫的主要生物学特性。【方法】在实验室条件下(27±1℃,RH 70%±5%,12L∶12D)以马铃薯Solanum tuberosum作为寄主,研究了石蒜绵粉蚧的生殖方式、发育历期、繁殖能力及各虫态的形态特征。【结果】石蒜绵粉蚧只能营产雌孤雌生殖,生活史包括卵、1-3龄若虫和雌成虫;卵单个散产且在母体外孵化,孵化时间约24min,雌成虫还能产下一部分不能孵化的卵;若虫期14~22 d,总历期33~64 d;雌成虫繁殖能力强,单头产卵量135~337粒,平均产卵244粒。各龄期主要形态特征为:卵呈长椭圆形,黄色且透明,具一对红棕色的复眼;1龄若虫呈黄色,行动活泼;2龄若虫体缘出现齿状突起;3龄若虫呈深黄色,体缘突起明显,尾瓣突出;雌成虫体表的白色蜡粉较厚实,体缘蜡突明显,体色变深,足呈深红色。【结论】从生殖方式、发育历期及繁殖能力等方面明确了石蒜绵粉蚧的主要生物学特性,结果预示该虫是一种重要潜在的危险性害虫。     

安徽羽叶报春同型花和二型花居群的遗传多样性和遗传结构分析

以安徽省秋浦河流域安徽羽叶报春(Primula merrilliana Schltr.)的2个同型花居群[包括铜陵市义安区凤凰山(FHS)和池州市贵池区阴山(YS)居群]和4个二型花居群[包括池州市石台县大王洞(DWD)、池州市贵池区谷村(GC)、池州市石台县立新村(LXC)和池州市石台县莲花田(LHT)居群]为研究对象,采用10对SSR引物对上述6个居群嫩叶的总DNA进行了PCR扩增,在此基础上对各居群遗传多样性和遗传结构进行了分析。结果表明:6个居群的等位基因数、有效等位基因数、稀有等位基因数、观测杂合度和期望杂合度的平均值较低,分别为4.8、2.8、2.7、0.29和0.43,并且,LHT和LXC居群的上述指标较高,而FHS和YS居群的上述指标较低;同型花居群的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度和期望杂合度均低于二型花居群,平均值分别为3.0、2.1、0.12和0.35,且无稀有等位基因。居群间的遗传分化系数和遗传距离均较小,平均值分别为0.34和0.56,且这2个指标与居群间的地理距离无明显相关性。由LHT和LXC居群向其他居群的基因流较大(0.057~0.065),而由FHS和YS居群向其他居群的基因流较小(0.044~0.046);并且,在同型花和二型花居群间存在明显的基因流屏障。分子方差分析(AMOVA)结果表明:同型花和二型花居群间的遗传差异不明显,且64.76%的遗传变异存在于居群内。聚类分析和主坐标分析(PCo A)结果均表明同型花和二型花居群间未明显分组。研究结果显示:安徽羽叶报春居群的遗传多样性较低;同型花居群的遗传多样性低于二型花居群,但二者的遗传分化并不明显。建议加强对秋浦河流域上游安徽羽叶报春居群及其生境的保护,并将同型花居群视为不同于二型花居群的独立单元进行遗传保护。     

外源葡萄糖对山定子生长及根系氮素代谢的影响

以有机质含量仅为0.65%的低碳冲积沙土为栽培基质,以当年生山定子幼苗为试材,分别添加与土壤本体微生物生物量碳(MBC)等量的碳量(2 g·kg^-1)、5倍MBC碳量(10g·kg^-1)的葡萄糖,以不添加葡萄糖为对照,处理后0~30 d内定期采集根系样品,研究外源葡萄糖对低碳土壤中山定子幼苗生长、根系构型及氮素代谢的影响.结果表明:5倍MBC碳源处理后山定子幼苗的株高、总生物量、总根长和根表面积分别显著增加12.3%、26.4%、23.2%和14.6%,而茎粗、根体积和平均直径无显著变化.等量及5倍MBC碳源处理均显著提高了山定子的根系活力,分别在第3和15天达到峰值,高于对照119.1%和75.7%.在整个处理期间,等量及5倍MBC碳源处理显著增加了根中NO_3^-、NO_2^-和NH_4^+含量;整体上,等量及5倍MBC碳源处理均显著增强根系中硝酸还原酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性,其中5倍MBC处理的作用最显著.5倍MBC的外源葡萄糖浓度更有利于促进低碳土壤中山定子根系中氮素的吸收代谢过程,诱导植株生长、干物质积累和根系构型改变.     

腹膜阴道成形术(罗湖二式)术后早期人工阴道微生态分析

目的了解先天性无阴道患者在腹膜阴道成形术后人工阴道微生态的状况,探讨人工阴道微生态评价的临床意义。方法选取31例腹膜阴道成形术术后的患者,在术后2~3周取其阴道分泌物进行微生态评价,以同期30例正常体检妇女作为对照组。结果先天性无阴道患者在腹膜阴道成形术后早期人工阴道已经有微生物生长,但普遍存在阴道微生态失衡状况,微生态失衡的发生率为100%。结论 (1)先天性无阴道患者在腹膜阴道成形术后早期已经建立阴道微生态系统。(2)腹膜阴道成型术后人工阴道的微生态失衡发生率明显增高;与正常女性相比有更高的微生态失衡比例;(3)评价术后人工阴道微生态状况对建立人工阴道的微生态评价体系具有重要指导意义。     

基于CA-Markov模型的三川流域景观格局分析及动态预测

以济南南部山区三川流域为研究对象,在ArcGIS和IDRISI平台的支持下,结合景观生态学原理,运用景观指数并引入Kappa系数对三川流域1990-2010年景观格局、动态度进行分析,最后运用CA-Markov模型对流域景观格局进行动态趋势预测.景观格局指数分析表明:三川流域景观类型以耕地、林地、建设用地和草地为主;受人类活动影响,1990-2010年三川流域耕地、林地面积减少,其余各景观面积均呈增加趋势;流域整体景观破碎度增加,斑块复杂度提高,各景观类型的分布渐趋均衡.景观格局变化前10年比后10年明显,人类活动对当地生态环境的影响较显著.Kappa系数表明:景观变化由各景观数量比例变化逐渐转变为各景观数量保持相对稳定下的景观空间位置上的变化.随着2000年后政策的引导,景观整体的变化渐趋稳定,人类活动对生态环境影响有所下降.CA-Markov模型预测结果表明,2010-2020年流域内各景观优势度下降,景观破碎度降低,均衡性持续提高;景观间的转入转出幅度不大,仅占总面积的3.08％,景观类型的转变主要发生在斑块交界处.总的来看,三川流域景观格局变化主要是耕地、林地面积减少,建设用地面积增加,生态环境更趋脆弱.     

基于整合网络和联合策略预测心肌梗死的新致病基因

目的:基于整合网络和联合策略预测心肌梗死的新致病基因.方法:从系统生物学的角度,提出基于蛋白质亚细胞定位信息,构建区域化的蛋白质互作的整合网络;通过疾病风险基因与已知致病基因的功能一致性程度和互作相关性的强度联合筛选的新策略,预测心肌梗死的新致病基因.结果:预测出10个心肌梗死的新致病基因(CCL19、CCL25、COMP、CCL11、CCL7、F2、KLKB1、HTR6、ADRB1、BDKRB2),其中8个基因(CCL 19、CCL25、CCL11、CCL7、F2、KLKB1、ADRB1、BDKRB2)经文献证实与心肌梗死的发生发展有着密切的联系;另外2个基因(COMP、HTR6)尚需实验验证.结论:基于整合网络和联合策略预测出10个心肌梗死的新致病基因,此方法为探索复疾病的致病基因提供了新的思路,有助于阐明复杂疾病的致病机理.     

奥沙利铂或5-FU对人肝癌HepG2细胞低氧低血清损伤后的增殖的影响

目的：探讨奥沙利铂或5．Fu单药对经低氧低血清损伤的人肝癌HepG2细胞增值的抑制作用。方法：体外培养HepG2细胞,建立低氧低血清细胞模型,分组选用奥沙利铂、5．F1J、奥沙利铂＋低氧、5-FU＋低氧、奥沙利铂＋低血清、5-FU＋低血清、奥沙利铂＋低氧低血清、5．Fu＋低氧低血清,48h后MTT法检测不同浓度的奥沙利铂或5-Fu对低氧、低血清和低氧低血清组的细胞增殖情况。结果：奥沙利铂或5．Fu对HepG2细胞的抑制作用呈明显的剂量依赖关系（P〈0．05）,细胞低氧低血清损伤同时奥沙利铂或5．Fu处理后的抑制率明显高于单独用药组（P〈0．01）。结论：奥沙利铂或5-Fu可抑制HepG2细胞的增殖,低氧低血清处理后,抑制作用更强。     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.