人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

慢病毒介导雌激素受体β在乳腺癌细胞中的高表达抑制上皮细胞间质转化相关基因的表达

目的：建立稳定高表达雌激素受体β（ERβ）蛋白表达的乳腺癌ZR75-1细胞株,检测其对上皮细胞间质转化（EMT）相关基因的影响。方法：将编码人ERβ的cDNA序列插入慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后收集病毒上清,感染乳腺癌ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定高表达含Myc标签的人ERβ的混合细胞集落,以及作为对照组整合有对照慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的混合细胞集落,提取细胞蛋白,用Myc抗体检测Myc-ERβ融合蛋白的表达,同时检测EMT相关基因Snail、E-Cadherin、N-Cadherin的表达水平和GSK-3β的磷酸化水平。结果：建立了稳定高表达Myc-ERβ融合蛋白的乳腺癌细胞株,和对照组相比,Myc-ERβ高表达抑制EMT相关蛋白N-cadherin和Snail的表达,增强E-cadherin分子的表达,抑制GSK-3β磷酸化水平。结论：建立了Myc-ERβ高表达的乳腺癌细胞株,发现ERβ高表达抑制EMT相关分子的表达,为深入研究ERβ分子在乳腺癌中调控EMT的机制奠定了基础。     

人EYA3基因真核表达载体的构建及其活性检测

目的：构建带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,获得myc-EYA3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法：采用PCR技术从乳腺文库中扩增人EYA3基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果：双酶切和测序鉴定表明,myc-EYA3真核表达质粒构建成功,转染ZR75-1细胞后成功表达;生长曲线实验结果表明,EYA3可促进乳腺癌细胞的生长。结论：构建了带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,myc-EYA3能在乳腺癌细胞ZR75-1中表达,且能促进该细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析

目的：构建人乳腺癌中雌激素受体B（ERβ）3种亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5的真核表达载体,测定不同亚型ERβ的转录活性。方法：以乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,PCR扩增ERβ1、ERβ2和ERβ5万基因,分别克隆到pXJ40-Mye载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与含雌激素应答元件（ERE）的萤光素酶（Luc）报告基因载体（ERE—luc）共转293T细胞,测定各亚型ER／3的转录活性。结果：构建了Myc—ERβ1、Myc—ERβ2和Mye—ERβ5表达载体,转录活性结果显示上述表达载体均具有活性,雌激素可升高ERβ5的转录活性,不能升高Eβ2和ER5的转录活性。结论：该研究为进-步探讨不同亚型ERβ在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

c-Fos不同结构域的真核表达及功能鉴定

目的：克隆c-Fos蛋白不同结构域基因片段,构建其含FLAG标签的真核表达载体,并鉴定其功能。方法：用PCR方法扩增获得c-Fos不同结构域片段基因,定向克隆至本实验室保存的FLAG-peDNA3．0载体中,瞬时转染293T细胞进行表达,并以本实验室保存的HA-e-Jun与FLAG-c-Fos不同结构域片段免疫共沉淀鉴定其相互作用区域,以佐证所构建的c-Fos结构域克隆的正确性。结果：测序结果表明c-Fos不同结构域序列正确,Western印迹显示可以在真核细胞中获得表达,并且免疫共沉淀结果显示c-Jun可以与c-Fos的bZIP区域特异性结合。结论：构建并表达了c-F0s不同结构域片段,为进一步研究与c-Fos相互作用的蛋白及其区域定位奠定了基础。     

两栖动物性染色体的多样性及其 进化机制的研究进展

两栖动物性别决定类型和性染色体具有多样性的特点。在已发现异形性染色体两栖动物中,大部分物种Y或W染色体大于其对应的X或Z染色体,少数物种具有高度分化的Y或W染色体。同时两栖动物类群内基因组大小差异大,性染色体间分子水平上也存在差异。高频转换、偶然重组和染色体重排可能是两栖动物性染色体进化过程中的关键机制。本综述通过对两栖动物性染色体进化的深入探讨,揭示其遗传性别决定的机理,有助于对两栖动物性别人工调控的进一步探索。     

放射诱导基因FHL2在人群中表达水平的检测

目的：分析FHL2基因在健康人群个体间表达的差异,评估FHL2作为一种新的辐射生物剂量计的可行性。方法：收集20例健康人血液样本,提取白细胞RNA进行反转录,以β-actin作为内参,利用实时定量PCR方法,检测人群中FHL2基因相对表达水平,并分析其差异。结果：FHL2和β-actin基因的实时定量PCR熔解曲线均为单峰,所得到的Ct值与相应的PCR产物呈良好的线性关系;20例血液标本中FHL2表达水平之间存在较大差异,且其表达水平与性别无关。结论：公认的放射诱导基因FHL2可能不适合作为辐射生物剂量计。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-7基因的克隆和表达

IGFBP-7是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)家族中的一员,具有一些抑癌基因的特征。利用重组PCR技术获得了IGFBP-7基因的全长编码区序列,并将其克隆到pcDNA3．1／His—Myc真核表达载体中,得到重组质粒pcDNA3．1／His—Myc—IGFBP-7。将该重组质粒瞬时转染人胚胎肾293T细胞,Westem-blot分析表明,IGFBP-7在293T细胞中获得了表达,为进一步研究IGFBP-7的功能奠定了基础。