HCV核心蛋白诱导Cos—7细胞凋亡

将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3—Core,用脂质体LipoVec^TM转染Cos—7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos—7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180—200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征。这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos—7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用。     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。     

用Vero细胞制备马抗狂犬病血清抗原

以Vero细胞为基质制备马抗狂犬病血清用抗原,以期建立有效、经济、简便的抗原制备方法。用含10％马血清营养液对Vero细胞作适应性培养,接种狂犬病毒,以含1％～3％马血清营养液作维持液培养病毒,于第5,8天收获病毒液,经灭活、浓缩、离心等制成抗原。第5,8天收获病毒滴度可稳定在7．010gLD50／mL以上,灭活抗原具良好的抗原性,用NIH法测定效价达6．0IU／mL以上,可用作抗原生产抗狂犬病血清。     

灵芝多糖GLP的抗疱疹病毒作用机理

从灵芝菌丝体中分离得到的多糖GLP具有抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的作用,并对GLP抑制疱疹病毒复制的作用机制进行了初步探讨.GLP对Vero细胞的CC50值大于2 000μg/mL,GLP在疱疹病毒感染细胞前、感染后和病毒感染细胞时加入到细胞悬液中的EC50分别为4.6、50和17μg/mL;而如果将GLP与细胞共同孵育后再用病毒去感染,其EC50为11μg/mL.同时,GLP抑制病毒感染的选择指数分别为435、40、118和182.如果在病毒感染细胞后加入GLP,在病毒的生物大分子的合成完成后而子代病毒粒子还未释放出来前去掉GLP,这时GLP对病毒感染就没有抑制作用.定量PCR试验进一步证明GLP发挥抑制疱疹病毒感染作用是通过阻断病毒感染细胞早期与细胞表明蛋白的吸附来实现的.     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis C virus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选.大约两周后,获得稳定表达的细胞株.经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50%,而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h.从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用.     

丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF-κB活性

将丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3.1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2.用脂质体LipoVecTM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κ B-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2～4倍,并呈明显的剂量相关性.表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用.这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性.     

HIV-1缺损慢病毒载体的高滴度制备及其介导的高效基因转移

近来,慢病毒载体引起了极大关注,己成为转基因操作中重要的工具。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,建立了大量制备HIV-1缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1×107IU/mL,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上。HIV-1缺损慢病毒载体可以高效转导人淋巴瘤等多种来源的细胞,RT-PCR检测显示外源基因GFP稳定表达达18个月以上,长期传代观测未检出p24抗原蛋白或可复制病毒。     

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度.方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a～1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用.结果:工程菌株在IPIG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40).结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究.     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.