从织锦芋螺中克隆α芋螺毒素序列

为了从我国南海产织锦芋螺（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）中分离新的毒素序列并研究其应用价值,进行了织锦芋螺毒素基因的分离工作．从织锦芋螺毒管中提取ｍＲＮＡ,以Ａ族芋螺毒素的信号肽编码部分和３′端非翻译部分的保守序列为引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增和序列分析方法获得新的芋螺毒素序列．结果得到两种不同的α芋螺毒素序列,两者都属于α４／７亚型芋螺毒素,预测其成熟肽序列分别为Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ（Ｃ端Ｇｌｙ可能被酰胺化）和Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ．采用传统的生化分离手段尚未从织锦芋螺中获得过α芋螺毒素序列,这两种α芋螺毒素作用的种属特异性、受体类型特异性和在小细胞肺癌的诊断和治疗中的应用价值有待进一步研究     

重组人血小板生成素在大肠杆菌中表达的研究

采用化学法全合成了编码人血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＴＰＯ）成熟肽Ｎ端１５３氨基酸的基因序列,构建基于该合成基因的表达质粒,结果以谷胱甘肽转硫酶－ＴＰＯ１５３（ＧＳＴ－ＴＰＯ１５３）融合蛋白的方式获得了占全菌蛋白４０％的高效表达．进一步采用ＰＣＲ方法分别对ＴＰＯ合成基因及ＴＰＯｃＤＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）序列进行定点突变,以降低这一区域的Ｇ－Ｃ含量．将突变序列分别插入到ｐＢＶ２２０表达载体中,重组质粒在转化大肠杆菌ＪＭ１０９后,均获得了表达,其中ＴＩＲ区突变后的合成基因表达产物约占全菌蛋白的１５％．为研究基因下游结构对表达的影响,在不改变氨基酸组成的基础上,构建了ＴＰＯ合成基因与ＴＰＯｃＤＮＡ的杂合序列表达质粒．研究结果表明翻译起始效率是影响ｒｈ－ＴＰＯ在大肠杆菌中表达的重要因素之一,同时基因下游序列的组成对表达水平也会产生影响．     

运用红外相机对鼎湖山森林动态监测样地鸟兽的初步调查

<正>广东鼎湖山国家级自然保护区(简称鼎湖山保护区)地处亚热带季风气候区南缘(23°09'21'–23°11′30″N,112°30′39″–112°33′41″E),面积1,155ha。该区属低山丘陵地貌,是热带向亚热带的过渡区,较好地保存了南亚热带常绿阔叶林等地带性植被,群落结构相对复杂,动植物种类丰富(孔国辉等,1998)。自1956年保护区设立后,陆生脊椎动物资源的调查和研究相对较少,仅见关于蝙蝠新记录(吴毅和彭洪源,2005)和鸟类多样性与生境类型之     

利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型

血友病乙是由凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 mRNA和带有靶位点的sgRNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting, HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(Factor Ⅸ coagulant activity, FⅨ: C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明,利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。     

过表达外源FUT8增加乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力

核心岩藻糖的修饰被认为是对糖蛋白进行转录后加工和功能调控的一种重要方式, 与肿瘤的发生发展密切相关, 但其在乳腺癌恶性转化过程中所发挥的生物学功能尚不明确. 本文构建了α1,6-岩藻糖基移转酶（FUT8）基因真核表达载体,将其转染人乳腺癌细胞Bcap-37, 实时PCR及Western印迹检测FUT8 mRNA和蛋白质表达, 通过细胞划痕实验和Transwell小室观察FUT8过表达对细胞体外迁移、侵袭能力的影响, 免疫共沉淀和Western印迹检测肿瘤细胞整合素、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）家族相关蛋白质表达水平变化. 结果显示,外源FUT8基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达均显著增加, FUT8过表达组细胞迁移和侵袭能力明显增强;上调FUT8基因表达可使Bcap-37细胞中核心岩藻糖基化的整合素-α3β1、MMP-2和MMP-9在蛋白质水平呈不同程度升高. 上述研究表明,FUT8可通过核心岩藻糖化修饰正性调控整合素-α3β1的功能, 诱导MMP-2、MMP-9的表达, 促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭.     

聚羟基脂肪酸酯纳米微球：结构特征、生物合成及其在生物技术和生物医药领域的应用

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate）PHA 纳米微球是很多微生物在营养失衡的情况下,在体内合成的一种可生物降解的细胞内聚酯,主要作为微生物的碳源及能量储备。天然 PHA 微球的内部是由疏水的聚酯链构成的疏水核心,其外层是由磷脂界膜及膜上嵌入或附着的包括 PHA合酶 PhaC 和 PHA 颗粒相关蛋白 PhaP 等蛋白构成的边界层。PhaC 通过共价键连接在PHA微球表面,而 PhaP 通过疏水相互作用吸附在 PHA 微球表面。通过将外源性功能蛋白与 PhaC 或 PhaP 进行融合表达,在重组微生物体内就能直接合成表面带有功能蛋白的纳米微球复合体。由于该纳米微球在微生物细胞内是以独立的包涵体形式存在,因此通过细胞破碎及离心等方法就能简便、有效地使其从细胞中分离并得以纯化。鉴于 PHA 微球这种表面易被修饰改造的特性,越来越多的功能蛋白通过与 PHA 微球表面蛋白（PhaC 或 PhaP）的融合表达,呈递在了 PHA 微球表面,使其成为一种廉价、高效的蛋白固定化及呈递的新技术。本文在介绍了 PHA 微球的结构特性及生物合成的基础上,着重综述了目前关于功能化 PHA 微球在蛋白纯化、固定化酶、生物分离、靶向递药、疾病诊断、成像技术及新型疫苗开发方面的研究现状及其未来在生物医药等领域的广泛应用前景。     

陕西壳斗科植物新类群

在大量野外调查和标本整理的基础上,作者对陕西省壳斗科植物的分类与分布进行了系统研究。本文报道了新变种3个:太白槲栎(Quercus aliena Bl.var.taibaiensis W.H.Zhang)、陕西槲栎(Quercus aliena Bl.var.shaanxiensis W.H.Zhang)、星毛枹栎(Quercus glandulifera Bl.var.stellatopilosa W.H.Zhang);新组合2个:城口青冈(Cyclobalanopsis fargesii (Franch.)S.Z.Qu et W.H.Z hang)、粉背青冈(Cyclobalanopsis hypargy-rae (Seem.)W.H.Zhang);陕西省分布新记录3个:多穗石栎(Lithocarpus polystachyus Rehd.)、大叶栎(Quercus griffithii Hook.f.et Thoms.)、长叶枹栎(Quercus monnula Y.C.Hsu et H.W.Jen);同时,澄清了枹栎(Q.glandulifera Bl.)命名上的一些问题。     

根据分子连接性指数和基团校正因子预测有机化合物在鱼体中的生物富集因子

研究了２３９种有机化合物的ＢＣＦ预测模型,结果显示根据分子连接性指数（ＭＣＩ）的线性模型不能准确计算及极性化合物的ＢＣＦ,也不适用于超疏水性化合物,在模型中引入基团校正因子后,极性经合物的计算误差明显降低。对数据进行曲线拟合,所得模型的估算精度进一步提高,最终确定以（＾０ｘ＾ｖ）＾２、（＾２ｘ＾ｖ）＾１／２、＾２ｘ、＾３ｘｃ、＾０ｘ＾ｖ及ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＣＯＯ等１０个基团校正团子为参数建立     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

通过启动子同源重组研究人凝血因子Ⅸ的组成型表达

为了探索定点整合基因治疗血友病B的可行性,开展了在HeLa细胞中的hFIX组成型表达研究.同源重组载体p921构建后,电穿孔转入细胞,经过GCV和G418克隆选择,通过特异性的PCR证实了同源重组的发生,hCMV启动子定点替换hFIX基因在非肝细胞中可以被启动子hCMV转录表达,显示人为进行基因表达调控的可行性.