榆树叶片虫瘿形成过程中蛋白质组学分析

为探究榆树虫瘿叶片形成的分子机制,以不同时期榆瘿蚜取食诱导的榆树叶片为试材,利用iTRAQ技术分析榆树虫瘿叶片形成过程中蛋白表达丰度的差异。通过质谱鉴定,共得到2 689个蛋白,与KEEG数据库进行比对,发现2 145个蛋白被注释到126个不同的代谢通路中,和本研究相关的蛋白有12条,涉及代谢途径的蛋白数量最多,为813(37.9%)个。未被榆瘿蚜取食的叶片与榆瘿蚜取食诱导叶片形成虫瘿的前期、中期、后期相比,差异蛋白分别有418个、390个、244个,筛选出虫瘿发育的共有差异蛋白29个,这些蛋白在榆瘿蚜取食形成虫瘿的初始形成期和成长分化期持续发挥作用的有过氧化物酶、过氧化氢酶等氧化还原酶类;在前期持续发挥作用的有翻译控制肿瘤蛋白TCTP和肌动蛋白;在榆瘿蚜取食形成虫瘿的开裂期起到重要抗性作用的有溶质的抗坏血酸过氧化物酶、70 kD热激蛋白等。在榆树虫瘿叶片发展过程中,数个蛋白基因涉及了应激防御反应、氧化还原、免疫系统过程和光合作用等生理反应过程,建议进一步进行榆树虫瘿叶片形成的分子机制研究。     

家犬用狂犬病口服基因工程疫苗的研究初探

中国的狂犬病主要由农村家犬通过咬伤传染所致,为了研制高效实用的家犬用狂犬病口服基因工程疫苗,本研究把狂犬病病毒G蛋白基因插入真核表达质粒pIRESneo,构建重组表达质粒pIRESneo-G,转化入鼠伤寒减毒沙门氏菌SL3261,构建重组口服疫苗SL3261-pIRESneo-G。通过口服免疫小鼠,检测免疫血清中和抗体水平及其病毒保护效果。结果显示,经小鼠口服免疫接种一次后第三周能产生高水平的中和抗体水平,达到WHO要求的0.5 IU/mL;免疫小鼠经肌肉注射100 LD50/0.03 m L的野毒株GX074后获56%保护效果。     

我国刺吸电位技术三十年应用及创新

刺吸电位技术(Electricalpenetrationgraph,EPG)是研究刺吸式昆虫取食行为的电生理仪器及其配套技术体系。我国从20世纪90年代开始将刺吸电位技术引入生物学和农业科学领域,主要应用于昆虫与植物的关系、植物抗性机理、昆虫传毒机理、转基因安全性评价、全球气候变化等方面,研究所涉及的昆虫种类包括半翅目的蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱、介虫、木虱和缨翅目的蓟马等。自2007年以来举办了5次全国性的EPG技术培训和研讨会,并对EPG仪器进行了创新设计,实现了EPG仪器的国产化,大部分消耗品(如金丝、银胶等)可以实现国内供应。人工饲料上的EPG记录、指标体系的优化等与EPG相配套的技术体系不断完善。目前我国主要是应用EPG技术进行各类农林相关刺吸式昆虫的研究,而在欧洲和美国,除农林害虫外,EPG近年来也开始应用于医学昆虫和畜牧昆虫方面的研究。欧美在波形库构建、仪器原理等方面比我们具有优势,我国今后应该加强在EPG仪器自动化和可视化、波形自动识别、指标体系完善等方面的工作,同时培养能够应用EPG的年轻一代,尝试将EPG应用到医学昆虫领域。     

海南坡鹿恢复生态学研究进展

海南坡鹿的个体总数已经超过1600头,分布地点已经扩展到10多个。海南坡鹿的恢复生态学研究主要包括种群恢复、栖息地管理和行为恢复等3个方面。就种群恢复而言,半野放是一种较稳妥的种群恢复管理方式,应加大投入;野生种群和野放种群的恢复现状缺乏了解,应加强监测与研究。栖息地管理是半野放种群恢复的基础和保障：而圈养、野放和野生种群的栖息地管理工作有待深入。海南坡鹿的恢复也面临行为恢复问题。这方面值得受到更多关注。     

CUT&Tag产物回收和建库方法的优化

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment,CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag,srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization,SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。     

川西亚高山针叶林土壤微生物及酶对林下植物去除的响应

生物多样性与生态系统功能的关系是生态学领域研究的热点与难点。但因受研究手段的限制,有关森林物种组成及其多样性变化对土壤微生物数量和酶活性影响的研究少有报道。采用人工去除灌草层的实验方法,研究了川西亚高山针叶林灌草层丧失对土壤微生物数量和酶活性的影响。结果表明:1)灌草层去除后,土壤细菌和真菌数量以CK(对照)RH(除草)RS(除灌),而土壤放线菌数量则以RHCKRS;2)灌草层去除后,土壤微生物群落构成发生改变,真菌比例有所下降;3)灌草层去除后,土壤酶活性随之发生变化,各种酶活性均以CKRHRS。表明林下灌草层去除,尤其是灌木层去除,导致土壤微生物数量下降、群落构成发生变化以及土壤酶活性下降,从而在一定程度上影响到森林生态系统的物质循环功能。     

Poly I∶C联合BCG-CpG复合佐剂对结核亚单位疫苗免疫效果的影响

目的探讨聚肌胞苷酸(Poly I∶C)联合BCG-CpG复合佐剂(BCG-CpG-DNA+Al,简称BC02)对结核亚单位疫苗的免疫效果是否有增强作用。方法 BALB/c小鼠分成5组,3组分别免疫含有不同剂量poly I∶C(10、25、50μg/剂)的结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;2组分别免疫PBS或(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02作为对照。末次免疫后第7 d,分离脾淋巴细胞,进行抗原特异性的IFN-γELISPOT检测、ELISA检测和淋巴细胞增殖检测以评价细胞免疫应答。豚鼠分成4组,1组免疫含有50μg poly I∶C/剂的新亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;3组分别免疫(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02疫苗、生理盐水和BCG作为对照。末次免疫30 d后,每只豚鼠皮下攻击250 CFU结核分枝杆菌。41 d后,解剖豚鼠,进行肝、脾、肺脏器综合病变评分和脾菌计数以评价保护力。结果含不同剂量poly I∶C的(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞分别经Ag85b和ESAT6-CFP10多肽刺激后,分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞频数、IFN-γ分泌量和细胞增殖指数均较(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02)组大幅度提高,且应答强度与poly I∶C呈现较为明显的量效关系。(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)组豚鼠脏器综合病变指数(27.5±20.4)和脾菌分离数[(4.22±0.59)log10CFU]均低于(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02组[35.8±27.3,(5.19±0.66)log10CFU],其中脾菌分离数的差异有显著统计学意义(P=0.003 0)。结论 Poly I∶C佐剂对结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02诱导的细胞免疫应答和抗结核保护力均有一定的增强效果。     

肝细胞癌中转录因子E2F7对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响

探讨肝细胞癌(HCC)中非典型性E2F家族成员E2F7在肝癌细胞生长、分化中的作用及可能涉及的分子机制.本研究运用实时荧光定量PCR检测38例原发性肝细胞癌及对应的癌旁组织中E2F7基因mRNA的表达情况;分别通过基因过表达和RNA干扰技术上调或下调E2F7基因表达,并运用实时荧光定量PCR和Western印迹检测肝癌细胞株MHCC-H中β-catenin及其靶基因cmyc的表达情况;双荧光素酶报告基因系统检测E2F7对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响;核浆分离实验检测过表达E2F7基因对β-catenin入核的影响;免疫共沉淀实验检测异位表达E2F7与内源β-catenin的相互作用.结果显示,肝细胞癌组织中E2F7基因的表达量显著高于相应的癌旁组织(P0.001);转录因子E2F7可与β-catenin相互作用并促进β-catenin进入细胞核.转录因子E2F7可以促进Wnt/β-catenin信号通路的活性.     

磷脂酰肌醇3-激酶γ/δ与炎症相关疾病

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类脂质与蛋白激酶家族,其主要通过在磷脂酰肌醇的肌醇环三位进行磷酸化产生胞内重要的第二信使——磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidyl inositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3)而发挥作用.磷脂酰肌醇3-激酶γ/δ(PI3Kγ/δ)是I类PI3K家族中的成员,其主要表达于免疫相关细胞中,这2种PI3K亚型参与先天性与获得性免疫应答.因此,PI3Kγ/PI3Kδ被视为因免疫反应调控异常导致的炎症疾病的治疗药物靶点.目前,利用特异性抑制剂靶向干预PI3Kγ和/或PI3Kδ,成为炎症相关疾病治疗的新策略.本文简介了PI3Kγ与PI3Kδ在不同类型免疫细胞中的功能;并就采用小分子特异性抑制剂,靶向抑制PI3Kγ和/或PI3Kδ在各类炎症相关疾病中的治疗作用和效果进行综述.     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测简

目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95％,酶比活力为200U/mgP（TAME）以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论：制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。