家犬用狂犬病口服基因工程疫苗的研究初探

中国的狂犬病主要由农村家犬通过咬伤传染所致,为了研制高效实用的家犬用狂犬病口服基因工程疫苗,本研究把狂犬病病毒G蛋白基因插入真核表达质粒pIRESneo,构建重组表达质粒pIRESneo-G,转化入鼠伤寒减毒沙门氏菌SL3261,构建重组口服疫苗SL3261-pIRESneo-G。通过口服免疫小鼠,检测免疫血清中和抗体水平及其病毒保护效果。结果显示,经小鼠口服免疫接种一次后第三周能产生高水平的中和抗体水平,达到WHO要求的0.5 IU/mL;免疫小鼠经肌肉注射100 LD50/0.03 m L的野毒株GX074后获56%保护效果。     

我国刺吸电位技术三十年应用及创新

刺吸电位技术(Electricalpenetrationgraph,EPG)是研究刺吸式昆虫取食行为的电生理仪器及其配套技术体系。我国从20世纪90年代开始将刺吸电位技术引入生物学和农业科学领域,主要应用于昆虫与植物的关系、植物抗性机理、昆虫传毒机理、转基因安全性评价、全球气候变化等方面,研究所涉及的昆虫种类包括半翅目的蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱、介虫、木虱和缨翅目的蓟马等。自2007年以来举办了5次全国性的EPG技术培训和研讨会,并对EPG仪器进行了创新设计,实现了EPG仪器的国产化,大部分消耗品(如金丝、银胶等)可以实现国内供应。人工饲料上的EPG记录、指标体系的优化等与EPG相配套的技术体系不断完善。目前我国主要是应用EPG技术进行各类农林相关刺吸式昆虫的研究,而在欧洲和美国,除农林害虫外,EPG近年来也开始应用于医学昆虫和畜牧昆虫方面的研究。欧美在波形库构建、仪器原理等方面比我们具有优势,我国今后应该加强在EPG仪器自动化和可视化、波形自动识别、指标体系完善等方面的工作,同时培养能够应用EPG的年轻一代,尝试将EPG应用到医学昆虫领域。     

CUT&Tag产物回收和建库方法的优化

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment,CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag,srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization,SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。     

肝细胞癌中转录因子E2F7对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响

探讨肝细胞癌(HCC)中非典型性E2F家族成员E2F7在肝癌细胞生长、分化中的作用及可能涉及的分子机制.本研究运用实时荧光定量PCR检测38例原发性肝细胞癌及对应的癌旁组织中E2F7基因mRNA的表达情况;分别通过基因过表达和RNA干扰技术上调或下调E2F7基因表达,并运用实时荧光定量PCR和Western印迹检测肝癌细胞株MHCC-H中β-catenin及其靶基因cmyc的表达情况;双荧光素酶报告基因系统检测E2F7对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响;核浆分离实验检测过表达E2F7基因对β-catenin入核的影响;免疫共沉淀实验检测异位表达E2F7与内源β-catenin的相互作用.结果显示,肝细胞癌组织中E2F7基因的表达量显著高于相应的癌旁组织(P0.001);转录因子E2F7可与β-catenin相互作用并促进β-catenin进入细胞核.转录因子E2F7可以促进Wnt/β-catenin信号通路的活性.     

磷脂酰肌醇3-激酶γ/δ与炎症相关疾病

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类脂质与蛋白激酶家族,其主要通过在磷脂酰肌醇的肌醇环三位进行磷酸化产生胞内重要的第二信使——磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidyl inositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3)而发挥作用.磷脂酰肌醇3-激酶γ/δ(PI3Kγ/δ)是I类PI3K家族中的成员,其主要表达于免疫相关细胞中,这2种PI3K亚型参与先天性与获得性免疫应答.因此,PI3Kγ/PI3Kδ被视为因免疫反应调控异常导致的炎症疾病的治疗药物靶点.目前,利用特异性抑制剂靶向干预PI3Kγ和/或PI3Kδ,成为炎症相关疾病治疗的新策略.本文简介了PI3Kγ与PI3Kδ在不同类型免疫细胞中的功能;并就采用小分子特异性抑制剂,靶向抑制PI3Kγ和/或PI3Kδ在各类炎症相关疾病中的治疗作用和效果进行综述.     

耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株的筛选

本研究通过小鼠体内实验检测我国部分地区结核分枝杆菌耐药菌株的毒力,以筛选耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株。收集从我国部分省份98例结核病患者痰培养液中分离出的结核分枝杆菌,用比例法药敏试验进行结核分枝杆菌一线和二线药物的药敏试验,筛选出对二线药物敏感而对一线药物利福平或异烟肼耐药或敏感的菌株,然后进行小鼠体内毒力实验,对异烟肼耐药相关基因katG和利福平耐药相关基因rpoB测序并进行基因突变分析。从98株菌中筛选出药物敏感谱清晰的40株,进行小鼠体内毒力实验。结果显示,共35株半数死亡时间≤H37Rv的半数死亡时间,其中18株耐利福平合并耐异烟肼、5株单耐利福平,7株单耐异烟肼、5株对利福平和异烟肼均敏感。通过小鼠毒力研究,分别筛选出基因背景清晰,半数死亡时间≤7d的耐利福平合并耐异烟肼的菌株1株、半数死亡时间≤7d单耐利福平和异烟肼的菌株各1株,作为耐药结核分枝杆菌感染小鼠模型所用菌株及进一步进行豚鼠等其他动物模型感染用候选菌株。     

全血γ干扰素释放试验在儿童和成人中的结核病诊断价值

为研究全血γ干扰素释放试验试剂盒QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)在中国(属结核病高发、卡介苗高接种地区)成人和儿童中的结核病诊断价值,入组临床怀疑结核病的儿童和成人患者各60例,进行QFT-GIT检测,并收集临床资料进行诊断分类。结果显示,在儿童中QFT-GIT诊断灵敏度为83.87%、特异度为92.00%、阳性预测值(PPV)为92.86%、阴性预测值(NPV)为82.14%;在成人中诊断灵敏度为78.57%、特异度为84.62%、PPV为84.62%、NPV为78.57%。结果证实QFT-GIT具有良好的结核病诊断价值,尤其在儿童中的诊断价值高于成人。     

朱砂叶螨HSP90基因克隆及原核表达

采用RT-PCR及RACE技术克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的热激蛋白90(HSP90)基因, 并进行序列分析, 得到一条长2 595 bp的cDNA序列, 该序列开放阅读框（open reading frame, ORF）为2 169 bp, 编码722个氨基酸, 分子量约为83.45 kDa, 理论等电点为4.81, 3′非编码区（untranslated region, UTR）为249 bp, 5′UTR为177 bp。通过Antheprot分析发现5个HSP90家族的签名序列及胞质HSP90特征序列MEEVD。同源性分析表明, 朱砂叶螨HSP90编码区核苷酸序列和其他已知的HSP90, 尤其是节肢动物昆虫的HSP90, 具有很高的相似性。将鉴定正确的原核重组表达质粒pET43a-TcHSP90, 转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(origami) 进行原核表达, 应用SDS-PAGE和Western blotting技术分离并检测融合蛋白, 结果表明构建的原核表达质粒可以在宿主菌中稳定、正确表达。朱砂叶螨TcHSP90基因的克隆、原核表达, 为进一步研究HSP90的性质和功能的研究提供有用的实验材料。     

大熊猫、小熊猫和黑熊血红蛋白的组份分离、结晶及氨基酸组成分析

 聚丙烯酰胺凝胶电泳和羧甲基纤维素柱层析都表明大熊猫(Ailuropodmelanoleuca)、小熊猫(Ailurus fulgens)和黑熊(Selenarctos thibetanus)的血红蛋白各有两个组份。在近似的条件下得到了它们的晶体。三种动物血红蛋白的氨基酸组成相似,而且N-末端氨基酸都是Val。有待进一步测定全部氨基酸顺序,以揭示它们之间的异同和亲缘关系。     

黄河中下游农业景观异质性对传粉昆虫多样性的多尺度效应——以巩义市为例

农业景观中非农生物所提供的服务是生态系统保持稳定的基础,随着农业集约化程度的加强,生物多样性的持续丧失是现代农业发展最突出的表现形式之一.本文以黄河中下游典型农业区巩义市为研究区,根据其典型的地貌特征(山地-丘陵-河川)来探究地貌类型、景观和生境3种尺度上景观异质性对传粉昆虫多样性的影响.本研究使用诱捕盘法(pan traps)获取传粉昆虫,采用多因素方差分析多尺度上农业景观异质性对传粉昆虫多样性的影响.结果表明: 共捕获传粉昆虫67012头,分属7个目、86个科.其中,优势类群为食蚜蝇科、花蝇科;常见类群为果蝇科、丽蝇科、蜂虻科、头蝇科、花萤科、瘿蜂科、胡蜂科、小蜂科、切叶蜂科、蜜蜂科.地貌类型对传粉昆虫多样性的影响最为显著(P<0.001),表明丘陵和山地地区为传粉昆虫的蜜源地;其次是生境尺度(P<0.05),但景观尺度和尺度间的交互作用的影响不显著.丘陵和山地地区的景观异质性对传粉昆虫多样性的影响为本地区不同地貌类型的景观规划和生物多样性保护提供了理论支持.