利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。     

耐氨固氮的催娩克氏菌的高密度培养研究*

根据耐氨固氮型催娩克氏菌的特点,对其发酵工艺进行了研究。确定了以葡萄糖为碳源,合理搭配适量的氮源及无机盐作为高密度培养的基础培养基;在培养的中后期,添加葡萄糖补充碳源,流加氨水补充氮源,同时将pH值稳定在6.5～6.8之间,通过控制适当的通气量、搅拌速度以维持适当的溶氧水平。培养终止时,NG13/pMC73A的菌数达到600～700×10⁸cfu/mL,与原有工艺相比,菌数提高十倍以上,而培养周期基本相同。     

Expression and regulation of hFIX minigene and cDNA driven by β-casein gene in mouse mammary gland

Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ,ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｕｓｉｎｇｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｈｕｍａｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｒａｗｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ.Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｉｌｋｏｆｆｅｒｓｓｅｖｅｒａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌａｄｖａｎｔａｇｅｓ:ｐｒｏｔｅｉｎｓｓｅｃｒｅｔｅｄｉｎｍｉｌｋ,ｗ…     

三峡大坝下游残存疏花水柏枝种群结构和动态

在三峡大坝下游的湖北宜都关洲设立1个40 m×40 m的固定样地,利用高度分级,比较2008与2009年两年间的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）种群数量动态,并运用点格局的Ripley＇s K函数分析了其空间格局变化及种群更新特征。结果表明,疏花水柏枝幼苗数量较少,种群更新存在一些障碍。空间分布格局与空间尺度及植株的大小密切相关。种群总体呈集群分布,各大小级多在9 m时出现最大的聚集强度,随着大小级的增加,聚集强度有减弱的趋势。幼苗与中株有较强的正关联。由于种群现有生境变化较大,应考虑迁地保护,并对原生种群加强长期动态监测;同时,开展疏花水柏枝适应机理研究,实施科学保护。     

嗜热与嗜常温微生物的蛋白质氨基酸组成比较

嗜热微生物的嗜热特性与其蛋白质的高度热稳定性紧密相关。为了探索嗜热蛋白质的热稳定机制,比较嗜热和嗜常温微生物的蛋白质在氨基酸组成上的差别,收集110对分别来自嗜热和嗜常温微生物的同源蛋白质序列,比较两组蛋白质各种氨基酸含量以及疏水性氨基酸组成、疏水性指数和荷电氨基酸组成的差别,结果两者在多种氨基酸含量上存在微小但统计学上显著的差别,嗜热蛋白质比嗜常温蛋白质具有较高的平均疏水性和荷电氨基酸组成。对两组蛋白质的“脂肪族氨基酸指数”进行分析,证明嗜热蛋白质之所以具有较高的脂肪族氨基酸指数是由于其亮氨酸含量较高,与影响该指数的其它几种氨基酸无关;从而认为该指数的意义值得怀疑。通过对大量同源嗜热蛋白质和嗜常温蛋白质氨基酸组成的比较,能够揭示一些有关蛋白质热稳定性的普遍规律。     

解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用

【目的】通过诱变育种提高解淀粉芽孢杆菌JY06利用精氨酸的能力,并将其用于降低酱油中的氨基甲酸乙酯及前体,从而提高酿造酱油的安全性。【方法】采用等离子诱变和紫外诱变两种诱变育种方法对解淀粉芽孢杆菌JY06进行突变,应用高通量筛选手段获得具有高精氨酸利用能力的突变株,验证突变株降低酱油中氨基甲酸乙酯的能力。【结果】获得了12株精氨酸利用能力提高的突变株,与出发菌株JY06相比,突变株C12和E6可使酱油中瓜氨酸含量分别降低了15.6%和14.7%,EC的含量分别降低了19.3%和13.1%。【结论】通过等离子诱变和紫外诱变进一步提高了解淀粉芽孢杆菌JY06降低酱油中EC及其前体瓜氨酸的能力,具有控制或减少酱油中生物危害物的应用潜力。     

高三尖杉酯碱对兔红细胞膜钙调蛋白的抑制作用

本实验显示高三尖杉酯碱能在>5μg/ml浓度以上抑制兔红细胞膜上钙调蛋白活性(P<0.05).推测高三尖杉酯碱能通过影响癌细胞钙调蛋白活性干扰细胞钙代谢和减少阿霉素和长春新碱的抗药性.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

钝齿棒杆菌丙酮酸激酶的克隆表达及其对精氨酸合成的扰动影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA 5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。丙酮酸激酶(pyruvate kinase)是EMP途径的限速酶,对胞内能量产生和代谢流调节方面都有重要作用。为提高葡萄糖消耗速率以缩短发酵周期,以钝齿棒杆菌基因组为模板,克隆得到pyk基因并将其在C.crenatum SYPA 5-5中成功表达,葡萄糖平均消耗速率为1.71 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5提高33.5%,精氨酸产量和最大产率分别为43.32 g/L和0.55 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5分别提高20%和19.5%。结果表明,加强表达丙酮酸激酶能增强EMP途径,提高精氨酸产量。     

体外研究UGT2B7基因SNP rs28365062对霉酚酸酯代谢的影响

目的:体外研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT2B7)基因SNP rs28365062对霉酚酸酯(MMF)代谢的影响,明确该位点变异是否与MMF副作用具有潜在关系。方法:采用基因重组、定点突变技术构建UGT2B7基因SNP rs28365062不同等位基因过表达载体,POLO3000转染法将重组过表达载体转染HEK293细胞,采用液相色谱-质谱联用仪(LC/MS/MS)系统检测霉酚酸(MPA)代谢产物--酰基化葡萄糖醛酸化物(Ac MPAG)24小时的生成量来评估转染不同等位基因细胞的酶活性。结果:成功构建过表达载体p IRES2-EGFP-prom(A)和p IRES2-EGFP-prom(G)并转染至HEK293细胞。LC/MS/MS系统检测结果显示携带G等位基因的突变型UGT2B7代谢MMF产生Ac MPAG的能力降低,产物Ac MPAG 24小时的生成量仅为野生型的18.60%(P0.001)。结论:UGT2B7基因SNP rs28365062可显著影响MMF代谢产物Ac MPAG的生成,可能是导致病人对MMF产生不同程度副作用的因素之一。