重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表达、分离纯化及活性分析

克隆鱼腥藻PCC7120基因组中脂肪氧合酶(ana-LOX)基因,对该功能基因进行了定点突变研究,确定了ana-LOX的最短功能基因长度,构建原核重组表达载体,对重组ana-LOX进行了分离纯化和性质研究。从GenBank中搜索到鱼腥藻PCC7120基因组中含有LOX基因,通过序列分析和比对,发现LOX功能基因位于双功能酶AOS(单加氧酶)-LOX的C端,通过定点突变研究,证实了ana-LOX活性中心位点为His197、His202、His369、Asn373和Ile455。通过逐步缩短基因长度的策略,获得ana-LOX基因的最短功能基因长度为1 254 bp。构建的表达载体pET-32a/ana-LOX转化入BL21(DE3)宿主内,在低温16℃条件下的诱导表达,重组脂肪氧合酶活力可达6 750 U/mL。表达产物通过Ni-NTA亲和柱进行分离纯化,比活达到11.4×104U/mg蛋白,酶活回收率为60.89%。重组ana-LOX最适反应温度45℃,最适反应pH 6.0,在常温下具有较好的稳定性,金属离子Fe2+、Mg2+、Ca2+对该酶存在明显的激活作用,而Fe3+和Cu2+对该酶有强烈的抑制作用。重组ana-LOX能够改善面团的显微结构。该研究获得了高效表达重组ana-LOX,为实现其在食品加工中的应用提供了参考。     

信必可都保对慢性阻塞性肺疾病患者树突细胞的调节

目的:探讨布地奈德/福莫特罗吸入剂(商品名:信必可都保)对于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseaseCOPD)患者外周血中树突状细胞(dendritic cell DCs)亚群、肺功能以及炎症反应因子的影响。方法:选取符合入组标准的COPD急性加重期患者,共80例,随机分成2组,每组40人。对照组给予常规对症治疗,实验组在此基础上给予信必可都保吸入,观察入组对象治疗前、治疗4周后两组患者外周血树突状细胞亚群(m DCs和pDCs)的水平、C反应蛋白(C-reactive protein CRP)、白细胞计数表达水平及CAT评分、肺功能的变化。结果:用药后m DCs和pDCs占外周血的百分比及m DCs/pDCs实验组及对照组均较用药前明显降低(P0.05),实验组优于对照组低,但差异无明显的统计学意义(P0.05)。用力肺活量(FVC)、FEV1占预计值百分比(FEV1%)、FEV1/FVC、CAT评分两组均较用药前有所改善,实验组较与对照组更明显(P0.05)。用药后C反应蛋白(CRP)、白细胞计数(WBC)较用药前有所改善,但用药后实验组与对照组相比无统计学差异(P0.05)。结论:信必可都保可有效改善COPD患者肺功能,改善其临床症状,但对树突细胞亚群的影响不明显。     

水土保持林恢复土壤可溶性碳氮组分动态与三维荧光特征分析

为探究水土保持林恢复过程中土壤可溶性碳氮含量变化及其有机组成特性,揭示水保林土壤固存可溶性有机质的效应及机制。选取了黄土丘陵区恢复12-45a的人工柠条、刺槐林以及撂荒地,分析了土壤可溶性碳氮含量及其三维荧光光谱特征与特性参数的动态变化。结果表明：随恢复年限的增加,3种植被土壤可溶性有机碳（DOC）、有机氮（DON）、无机氮（DIN）的含量均呈增加趋势,并且相同恢复年限下DOC、DON、DIN含量总体表现为撂荒 < 柠条 < 刺槐;但柠条和刺槐林土壤DOC：DON及二者占总有机碳、全氮比例并未持续增加,到恢复45a时DOC占总有机碳比例以及DOC：DON均以撂荒地最高,刺槐林最低,DON占全氮比例则表现相反。三维荧光结合平行因子分析得出所有样地土壤可溶性有机质（DOM）主要有大分子腐殖物质（C1）、低分子量类富里酸（C2）、类色氨酸（C3）及农业措施输入的腐殖物质（C4）4个组分,并且以C1组分占比最大,平均达37.4%。随恢复年限增加,3种植被土壤DOM中C3组分占比升高,C2和C4组分占比降低,C1组分占比在柠条和刺槐林中升高,在撂荒地中则降低。不同植被土壤可溶性有机质荧光指数（FI）、新鲜度指数（β：α）及自生源指数（BIX）差异不显著,分别为1.63、0.58、0.59;不同恢复年限撂荒地腐殖化指数（HIX）没有差异,但柠条和刺槐林显著高于撂荒且随恢复年限增加先增大后稳定。综上,水保林持续恢复可以显著提升土壤可溶性碳氮含量,也使土壤可溶有机质组成趋向复杂和相对稳定,利于累积固持,特别以刺槐林效应最明显。     

Bacillus subtilis fmbJ脂肽类抗菌物质的分离和鉴定

对Bacillus subtilis fmbJ脂肽类抗菌物质的分离和鉴定进行了系统研究。通过HPLC层析确定Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质由多种组分构成,其中含有保留时间与surfactin相似的成分。通过TLC层析和原位酸解确定Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质含有两个具有闭合肽键类的物质,其中之一为迁移率Rf与标样surfactin非常相近的组分。通过 ESIMS分析检测到Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质含有分子量与fengicin相同的m/z1449.9、m/z1463.8、m/z1477.8、m/z1491.9和m/z1505.9五种同系物,和分子量与surfactin相同的m/z1008.8、m/z1022.8和m/z1036.8三种同系物。     

从人胃肠道源乳杆菌株中初步筛选耐酸耐胆盐优良株

目的筛选对酸和胆盐耐受性均较强的优良乳杆菌株。方法模拟人体胃酸环境（pH=3）和十二指肠高胆盐环境（胆盐含量=3‰）测定104株人胃肠道源乳杆菌在酸性及高胆盐环境下作用4h后的存活菌数,并与对照相比较。对结果进行统计学分析。结果16株菌在酸性环境及高胆盐环境下4h后的活菌下降对数值均小于2。筛选出3株具有较强耐酸耐胆盐能力的乳杆菌株。结论大多数人胃肠道源乳杆菌对酸和胆盐的耐受能力均不强,对酸的耐受性普遍强于对胆盐的耐受性。     

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-Ⅰ在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-Ⅰ,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%.Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Scphadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定.纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性.     

不同施肥处理对'秦美'猕猴桃贮藏性及其品质的影响

以秦美猕猴桃为材料,对不同施肥处理的果实后熟过程中软化、腐化过程进行观察统计,并在果实采后4个具有代表性的后熟时期(硬度分别为15 kg/cm2左右、8~7 kg/cm26、~5 kg/cm25、~4 kg/cm2)进行可溶性固形物、可滴定酸、Vc、可溶性糖等营养指标测定.结果显示:(1)从后熟过程中软化、腐化统计看,3个施肥处理(A、B、C)的贮藏品质与对照(CK)间差异明显,C处理(氮肥 磷肥 农家肥)的猕猴桃贮藏期最长,软化、腐化出现得最晚,较对照分别延长15 d、27 d,贮藏性最好;(2)3个施肥处理的营养指标与CK间差异明显,C处理与CK和A处理差异显著.表明在猕猴桃生产中采用氮肥 磷肥 农家肥相结合的施肥方式可显著延长猕猴桃果实贮藏期(后熟期),并可显著提高猕猴桃果实的食用和营养品质.     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobiallipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(PorcineKidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(MedianToxicosisDose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57mg/L、18.9mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(CytopathicEffects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制。由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。     

腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与原核表达

脂肪酶是重要的工业用酶,在食品加工、生物柴油的合成等领域具有广泛的应用。但是在应用中有机溶剂对脂肪酶具有一定的毒性,因此获得耐有机溶剂的脂肪酶基因并实现高效表达是脂肪酶规模化应用的前提。本研究应用PCR技术首次从耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36基因组DNA中扩增得到脂肪酶Ⅲ基因lip3(GenBank AccessionNo.FJ979867),其编码区长度为741bp,编码247个氨基酸,推测蛋白分子量大小为31.6kD。它与腐生葡萄球菌lip3推测的基因(GenBank AccessionNo.AP008934)只有83%的同源性。将该基因与大肠杆菌表达载体pET-DsbA连接,转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-DsbA-lip3,在pH8、25oC条件下,OD600为1.0时用0.4mmol/LIPTG诱导12h酶活达到25.8U/mL。重组酶在甲醇、正己烷、异辛烷、正庚烷等有机溶剂中具有较好的耐性。lip3基因的克隆及在大肠杆菌中有效表达的研究为进一步进行基因工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。     

Plantaricin 163对热杀索丝菌的抗菌活性及其作用机制

【背景】热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)为鲫鱼在4°C贮藏过程中的主要腐败菌,Plantaricin 163是由植物乳杆菌产生的一种新型广谱细菌素,能明显延长鲫鱼的贮藏期。【目的】研究Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌活性和作用机制。【方法】通过测定最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration)和杀菌动力学了解Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌效果,并从电导率的变化、核酸和蛋白的泄露、流式细胞实验、扫描电镜和透射电镜观察等4个方面探讨Plantaricin 163对热杀索丝菌的作用机制。【结果】Plantaricin 163对热杀索丝菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,优于Nisin的作用效果,作用方式为杀菌模式,6 h内能完全杀死热杀索丝菌。Plantaricin163能够通过增加热杀索丝菌细胞膜的通透性,增加胞外电导率,进而破坏细胞膜完整性,导致内容物泄漏,并影响细胞的外部形态和内部结构,从而导致菌体细胞瓦解死亡。【结论】Plantaricin 163可以破坏热杀索丝菌的细胞膜和内部结构,发挥抗菌活性。