MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

血小板衍生生长因子受体β对骨肉瘤细胞株HOS增殖的影响

血管形成是肿瘤生长过程中不可或缺的因素。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)通过与其配体结合刺激新生血管形成,与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究表明其亚型PDGFRβ高表达于大多数骨肉瘤病人标本及细胞株中,促进肿瘤增殖,但具体机制仍未明确。在本研究中,分别对HOS骨肉瘤细胞株进行特异性配体PDGFBB刺激处理及小干扰RNA (siRNA)敲降PDGFRβ处理,然后检测其增殖、细胞周期及相关蛋白的表达。结果表明:经过PDGFBB刺激后细胞增殖能力增强;细胞周期结果显示处于G1期的HOS细胞数量增多,S期和G2/M期细胞数量减少,G2期相关蛋白Cyclin B1和CDK1以及G1期相关蛋白CyclinE2和CDK2表达增高,提示PDGFBB可能促进了G2/M期转化。而经siRNA干扰后,PDGFRβ在mRNA和蛋白水平均显示表达量下降;细胞增殖受到抑制。检测细胞周期结果发现在敲降PDGFRβ后,进入S期的细胞数量增加了约9.71%,而G2/M期的细胞数量约减少了6.78%,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2明显降低,提示发生了S期阻滞。因此我们推测,PDGFRβ通过调控细胞周期进程影响骨肉瘤细胞的增殖。本研究为PDGFRβ影响HOS细胞增殖及其潜在机制提供了理论依据,为PDGFRβ可以作为治疗骨肉瘤的潜在治疗靶点提供了理论依据。     

沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响

目的研究Bmi-1对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响及机制。方法阿霉素处理MCF-7／Bmilsi、MCF-7／GFPsi和MCF一7细胞株,M1Tr法检测阿霉素的IC50;DAPI检测阿霉素处理后细胞的凋亡,计算凋亡指数（apoptosisindex,AI）;Western印迹检测相关蛋白P53,phospho—Akt（Ser473）（pAkt）,totle—Akt（tAkt）,Bcl-2,Bax的表达。结果阿霉素处理72h的MCF-7／Bmi．1si组生长抑制率明显高于MCF-7和MCF-7／GFPsi组,MCF-7／Bmilsi组的IC50为（0．15±0．02）μg／ml,而MCF-7组和MCF-7／GFPsi组的IC50分别为（0．87±0．06）μg/ml和（0．81±0．02）μg/ml（P〈0．05）。阿霉素处理48h后用DAPI检测凋亡发现,MCF-7／Bmi．lsi＋doxorubiein组可见大量凋亡细胞,而MCF-7＋doxorubicin和MCF-7／GFPsi＋doxo—rubicin组出现较少的凋亡细胞,MCF-7／Bmi-1si＋doxorubicin组凋亡指数明显高于对照组（P〈0．05）。进一步研究发现：MCF-7／Bmi．1si＋doxorubicin组与MCF-7＋doxorubiein及MCF-7／GFPsi＋doxorubiein组相比,P53表达量增加,tAkt表达未发生改变,而pAkt的表达明显减少,另外,Bcl-2表达量减少而Bax表达量增加,差异具有显著性（P〈0．05）。结论沉默Bmi—l基因表达能增加MCF-7细胞对阿霉素的敏感性,增加阿霉素引起的凋亡。     

EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP—pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到Fr67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。     

抑制Plk1表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

研究食管癌细胞中Plk1表达被抑制后对化疗药物敏感性的影响,为进一步研究开发基于Plk1食管癌分子靶向治疗奠定基础。化学合成法合成特异性的短链Plk1siRNA,脂质体转染法将短链siRNA分别导入3代表性的食管癌细胞系;采用RT-PCR和蛋白质印迹法确认siRNA对Plk1表达的抑制效果;MTT分析观察抑制Plk1表达对食管癌细胞化疗药物敏感性的影响。半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,合成的特异性短链Plk1siRNA在mRNA和蛋白质水平上均能高效、特异性地抑制所使用的3代表性食管癌细胞系中Plk1的表达,抑制程度约90%。MTT分析结果表明,siRNA抑制Plk1表达后,能显著提高3食管癌细胞系对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性。由此证实,siRNA介导的Plk1表达抑制能显著提高食管癌细胞对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性。     

双歧杆菌在家兔实验性肝坏死模型中的靶向增殖研究

目的 探讨双歧杆菌在海扶超声聚焦刀（HIFU）制作的肝凝固性坏死模型中的靶向性增殖的可能性。方法 用HIFU制作成家兔肝凝固性坏死模型,经耳缘静脉注射两歧双歧杆菌活菌,通过检测注射前后家兔体温、红细胞、白细胞和血小板等生理指标的变化和注射后主要器官的组织切片来评价双歧杆菌作为基因治疗载体系统的安全性,同时对肝坏死模型等组织切片还做了革兰染色检测,证明了双歧杆菌在坏死组织中的增殖。结果 双歧杆菌能够在HIFU制作的肝凝固性坏死模型中增殖、而这一增殖过程并不影响家兔的生命安全。结论 双歧杆菌作为肿瘤基因治疗的靶向载体系统是安全和可行的,HIFU制作的肝坏死模型可以用于双歧杆菌基因治疗的靶向载体系统的辅助研究。     

应用SYBR实时荧光定量Real—TimePCR法检测人宫颈癌MCPH1 mRNA表达

目的 应用SYBR实时荧光定量RT-PCR法检测MCPH1/BRIT1 mRNA的表达.方法 提取人宫颈癌总RNA,经逆转录PCR获得靶基因（MCPH1）及管家基因（GAPDH）的CDNA,采用SYBR Green 荧光实时定量法检测,以GAPDH基因作为内参,计算各组MCPH1 mRNA的相对表达量.结果 在31例宫颈癌标本中,MCPH1基因mRNA的表达,19例癌比正常低,1 例癌比正常高,其余标本无统计学意义;6例癌比癌旁低,1例癌比癌旁高,其余无统计学意义.结论 利用SYBR实时荧光定量RT-PCR检测出人宫颈癌中MCPH1基因mRNA的表达下调,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用及功能奠定了基础.     

人PRR11启动子的结构与功能初步分析

PRR11（proline-rich protein 11,PRR11）是我们最近发现的一个新的肿 瘤相关基因.初步研究表明, PRR11参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生 物学过程．为了进一步研究PRR11基因的转录调控机制并全面解析其功能,本研究 对PRR11基因的启动子进行了克隆鉴定和初步分析．首先,应用5' RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了PRR 11基因的转 录起始位点,发现了其具有多个转录起始位点．通过PCR定向克隆和DNA blunting 技术,构建了6个相互重叠并覆盖PRR 11基因转录起始位点附近约2.0 kb区域的 PRR 11基因启动子荧光素酶报告基因重组体．启动子活性分析表明,PRR 11基因 启动子主要定位于转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域内．采用转录因子 结合位点预测分析软件分析表明,PRR 11基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有 典型的GC盒、CCAAT盒以及潜在的经典转录因子E2F1和MYB的结合位点,提示Sp1、 NF-Y、E2F1和MYB等经典转录因子可能参与PRR 11基因的转录调控．     

沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.