严重急性呼吸系统综合征冠状病毒N蛋白对甘油三酯和总胆固醇含量的影响

目的:研究严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白对甘油三酯和总胆固醇含量的影响。方法:检测分析144例SARS患者甘油三脂和总胆固醇含量在发病后的变化;将小鼠随机分组,分别注射生理盐水和SARS-CoV N蛋白,连续给药9 d后检测小鼠血清中甘油三酯和总胆固醇含量的变化。结果:SARS患者的甘油三酯和总胆固醇含量随发病时间有升高变化(P0.05),在发病40 d前后甘油三酯和总胆固醇含量超标的病例数占本时间段内的病例数的比例显著高于其他时间段,而且超标的含量也明显升高。SARS-CoV N蛋白使小鼠体重明显高于对照组(P0.05),甘油三酯含量在39和51 d明显高于对照组(P0.05),总胆固醇含量在21和39 d也明显高于对照组(P0.05)。结论:SARS-CoV N蛋白可以升高小鼠的甘油三酯和总胆固醇的含量,其升高最为明显的时间段与SARS患者的甘油三酯和总胆固醇含量升高的时间段基本一致。由此推测,SARS-CoV N蛋白可能是促使SARS患者发病后甘油三酯和总胆固醇含量升高的重要原因。     

超抗原SEA增强小鼠对HBV DNA 疫苗的免疫反应

观察超抗原SEA(D227A)的真核表达载体(pmSEA),对HBVDNA疫苗诱导Balbc小鼠(H2d)免疫应答的调节作用。肌内注射空载体pcDNA3、HBVDNA疫苗加pmSEA佐剂(pHBVS2S+pmSEA)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs;ELISPOT检测分泌IFNγ的脾淋巴细胞;4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性。HBVDNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度明显高于不加佐剂组,其IgG1IgG2a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.282与10。HBVDNA佐剂组均能增强IgG1和IgG2a的产生,是不加佐剂组的1.36、1.73倍。佐剂组小鼠脾淋巴细胞IFNγ的分泌量是不加佐剂组2～3倍。CTL细胞杀伤活性(E:T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:69.77%±7.5%、42.81%±7.7%,差异显著(P<0.05)。HBVDNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTL反应;pmSEA佐剂能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

siRNA抑制HIV-1基因表达的研究

RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)现象是动植物体内的一种序列特异性的、转录后基因沉默的过程.在哺乳动物细胞中,19～25个核苷酸长短的双链siRNA(smallinterferingRNA)可有效地抑制基因表达.利用pBS/H1SP载体,它表达的双链RNA的转录产物可以用来抑制特异性HIV-1基因的表达.在siRNA实验中,为了比较由H1启动子转录的siRNA在细胞内的作用,使用以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的载体——pEGFP-C1质粒,在荧光显微镜下,很容易地看到EGFP在细胞中表达.将HIV-1siRNA表达载体与表达相应EGFP-HIV融合基因的质粒,共转染人胚肾293细胞,结果表明,和对照质控载体相比,转染了pHIV-siRNA质粒的细胞中EGFP-HIV的表达得到显著抑制.通过该途径,筛选出能抑制HIV-1基因表达的有效siRNA.此外,还在同一载体上表达两种或三种siRNA,分别针对不同的HIV基因,获得了良好的抑制效果.     

脂多糖通过补体途径诱导小鼠产生白三烯B4

目的:研究脂多糖(LPS)对人血清中补体系统的激活及在小鼠模型中诱导产生白三烯B4(LTB4)。方法:LPS包被ELISA板,利用血清中补体C4、C3沉积实验检测补体成分被LPS活化的情况,通过尾静脉注射小鼠LPS后不同时间点ELISA定量检测LTB4,评价补体系统的活化和炎症因子的产生。结果与结论:血清系统ELISA检测发现LPS可以激活补体系统,且以凝集素途径为主;动物实验中LTB4被LPS诱导后1～3 h达到峰值,之后回落。C1INH对血清补体活化和动物模型中LTB4的产生均有显著抑制。     

人源Plk1及其结构域蛋白的融合表达及纯化

目的:表达纯化GST-Plk1及GST-Plk1 KD、GST-Plk1 PBD融合蛋白,以用于Plk1与其结合蛋白相互作用的研究。方法:PCR扩增Plk1全长及其KD、PBD结构域基因,定向克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,在大肠杆菌中分别表达其融合蛋白,并利用GSH交联的琼脂糖珠纯化。结果:人源Plk1及其结构域基因被克隆至p GEX-4T-1载体中;通过亲和纯化获得带有GST标签的Plk1及其结构域的融合蛋白。结论:构建了GST-Plk1、GST-Plk1 KD、GST-Plk1 PBD表达质粒并表达了相应的融合蛋白,为研究Plk1体外相互作用蛋白提供了基础。     

重组人MASP2蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:获得酶原形式的重组人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)。方法:在大肠杆菌中诱导表达重组人MASP2全长蛋白,包涵体裂解后,经复性、透析、浓缩、考马斯亮蓝染色、SDS-PAGE及Western印迹,鉴定纯化结果及酶活性。结果:复性后的MASP2蛋白经考马斯亮蓝染色未见杂带。自激活实验表明,当MASP2浓度在1μmool/L以下时,无论在4℃还是37℃,都能较稳定地保持酶原形式;蛋白浓度为3.5μmool/L时只能在4℃保持稳定,37℃发生自激活;蛋白浓度达到12μmool/L后,在4℃时已不能稳定存在。结论:获得了较纯的重组人MASP2蛋白,且具有自激活活性。     

利用双萤光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控

目的:构建细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)启动子萤光素酶报告系统,用于转录因子FoxM1转录活性调控研究。方法:利用瞬时转染、实时荧光定量PCR及Western印迹,验证人胚肾HEK293细胞中FoxM1对Cyclin B1 mRNA的转录及蛋白表达的调节作用;利用PCR技术从人宫颈癌HeLa细胞基因组中钓取人源Cyclin B1的启动子序列,克隆至pGL3-Basic Vector中,构建含有Cyclin B1启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒pGL3-Cyclin B1;通过瞬时转染、Western印迹及萤火虫/海肾萤光素酶双报告系统,研究c-Abl酪氨酸激酶对FoxM1转录活性的调控作用。结果:构建了Cyclin B1萤火虫萤光素酶报告系统,该报告系统可用于FoxM1转录活性研究;c-Abl酪氨酸激酶能够显著抑制FoxM1靶向Cyclin B1启动子的转录活性,且抑制作用依赖c-Abl的激酶活性。结论:pGL3-Cyclin B1萤光素酶报告系统可用于研究c-Abl酪氨酸激酶介导的FoxM1转录活性调节。     

HeLa/GFP-Plk1/Cherry-H2B稳定细胞系的构建简

目的：构建可研究Polo样激酶1（Plkl）定位的HeLa细胞系。方法：用PCR方法扩增Plkl基因,定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygm载体中,构建pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,向HeLa细胞系中依次转染pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro、pRex-Cherry-H2B-IRES-Hygro,构建Hela/GFP-Plkl/Chef．ry-H2B稳定细胞系;激光共聚焦显微镜观察Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系在不同有丝细胞分裂期时Plkl的定位。结果：质粒酶切及测序证明pRex-EGFP-Plkl-IRES-Hygro载体构建正确;在Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系有丝分裂中期和末期时,观察到Plkl分别定位于着丝粒和中间体上。结论：构建了Hela/GFP-Plkl/Cherry-H2B稳定细胞系,为研究Plkl在有丝分裂不同时期的调控机制提供了细胞模型。     

以霍乱毒素B亚基为佐剂的SARS病毒核酸疫苗的构建

由于冠状病毒主要通过粘膜系统侵人细胞,因此有效的粘膜免疫效应对于SARS的免疫预防具有重要作用。通过将SARS冠状病毒免疫保护相关的核衣壳蛋白和辐条蛋白与霍乱毒素B亚基基因融合,并克隆至真核基因表达载体,所构建的DNA候选疫苗在细胞内可表达霍乱毒素B亚基与SARS抗原的融合蛋白,从而可用于评价是否可有效产生粘膜免疫。     

冠状病毒核衣壳蛋白与延伸因子-1α的相互作用

目的:分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)和229E冠状病毒(HCoV-229E)核衣壳蛋白与细胞延伸因子(EF)-1α的相互作用、翻译抑制效应及与多核细胞形成的关系。方法:构建、表达及纯化SARS-N蛋白和229E-N蛋白的GST融合蛋白,用GST-pull down方法分析其与过表达的EF-1α及内源EF-1α之间的相互作用;构建和表达SARS-N蛋白和229E-N蛋白的GFP融合表达载体,转染293T细胞,通过共聚焦显微镜分析SARS-N蛋白和229E-N蛋白的亚细胞定位及多核细胞的形成;在293T细胞中过表达SARS-N蛋白或229E-N蛋白,通过Co-IP分析其与EF-1α的相互作用。分别在细胞内和体外翻译系统中分析二者抑制报告基因翻译的程度。结果:SARS-N蛋白和229E-N蛋白都定位于细胞质,并不像其他冠状病毒的N蛋白那样定位到细胞核;二者都能诱导形成多核细胞,但229E-N蛋白导致细胞形成多核细胞的时间要晚;二者都能与EF-1α相互作用并且共定位于细胞质,二者都能导致EF-1α形成多聚体;二者在细胞内及细胞外对报告基因都有抑制翻译效应。结论:SARS冠状病毒和229E冠状病毒的核衣壳蛋白均定位于细胞胞质,可与EF-1α相互作用,导致EF-1α形成多聚体,抑制报告基因翻译及导致细胞形成多核。