表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RTPCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P75的下游,得到重组转移载体1175HA。以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wtFPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含Xgal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPVHA。以间接免疫荧光法证实感染rFPVHA的CEF表达了HA。rFPVHA在免疫7日龄SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天。在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPVＨＶ能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救

参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204。然后将其与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验。结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似。该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料。     

空肠弯曲菌脉冲场凝胶电泳分子检测方法的建立及应用

摘要：【目的】建立空肠弯曲菌脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)图谱分型方法。【方法】在PFGE基本程序基础上,通过调整菌液浓度、Seakem Gold○R琼脂糖凝胶浓度、蛋白酶K浓度、洗涤方式和限制性内切酶SmaⅠ浓度,进行程序的比较与优化。应用PFGE技术对不同来源分离株进行分析。【结果】37株空肠弯曲菌脉冲场凝胶电泳图谱显示分离株均产生了6-24条电泳带,条带数量适中,清晰易读;系统进化树显示,可分为4个遗传谱系,分离株主要分布于PFGE遗传谱系     

利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株

利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6 2全禽源的重配AIV。将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cD-NA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒。将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72~90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,最终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株。     

家鸭中H8N4亚型流感病毒株A/duck/Yangzhou/02/2005的全基因克隆和序列分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测,分离鉴定出国内报道的第一株H8亚型禽流感病毒。应用流感病毒通用引物成功地扩增出H8N4亚型禽流感病毒A/duck/Yangzhou/02/2005株(简称Dk/YZ/02/05)的全基因序列。将Dk/YZ/02/05的基因组核苷酸全序列与网上公布的基因序列进行比较分析,结果表明:Dk/YZ/02/05(H8N4)的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框;其推导的血凝素(Heamgglutinin,HA)氨基酸剪切位点序列为P-S-V-E-P-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列;神经氨酸酶(NA)在第48位氨基酸后无20个氨基酸的缺失;非结构蛋白(NS)79~84位也没有氨基酸的缺失。     

禽病原性大肠杆菌aes-31基因突变株的构建和致病性鉴定

【目的】通过禽病原性大肠杆菌(APEC)aes-31突变株的构建和动物实验来初步鉴定此基因片段对E058株的毒力影响。【方法】对在芯片杂交试验中筛选到的APEC E058株体外表达差异基因片段aes-31(来自SSH方法筛选到的E058株特异片段),用SSH引物从重组质粒中扩增出目的片段,克隆到pGEM-Teasy Vector中,然后用SphⅠ和SpeⅠ从中切下此片段,将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性重组质粒pMEG375-aes-31,将突变载体转化到受体菌中,再和APEC E058株进行固相杂交,根据同源重组原理,筛选出基因突变株E058(Δaes-31)。【结果】E058株和突变株的LD50没有明显差别,突变株对35日龄SPF鸡的致死率高于E058株;两者接种鸡6 h内,E058(Δaes-31)突变株在各内脏器官和血液中的细菌数和E058株差异均不显著;接种鸡24 h后,E058(Δaes-31)突变株在脾脏和肺中的细菌数显著大于E058株,差异显著,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和血液中细菌数显著大于E058株,差异极显著;接种鸡48 h后,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和脾脏中的细菌数比E058株多,差异极显著,而肺脏和血液中的细菌数均无明显差异;48 h后突变株所引起的感染鸡的大肠杆菌病变比亲本株稍严重。【结论】以上数据表明aes-31有可能与E058株毒力的负调控有关。     

不同溶氧对谷氨酸棒杆菌代谢的影响

【目的】以谷氨酸棒杆菌为研究对象,分别控制在0、30%、50%3种溶氧水平下进行发酵,分析不同溶氧水平下代谢的变化。【方法】通过检测发酵代谢物中有机酸、氨基酸的含量,以及测定代谢途径中关键酶活性及其编码基因的表达情况来考察不同溶氧水平下物质代谢发生的变化。通过检测胞内还原力和ATP的含量来分析不同溶氧水平对能量代谢产生的影响。【结果】谷氨酸棒杆菌代谢支路受溶氧的影响而发生改变,氨基酸、有机酸的产量也随之改变。特别是在低溶氧(0)情况下,细胞内氧化磷酸化减弱,导致维持生命活动所必需的ATP供应减少,因此细胞通过增强底物水平磷酸化来产生ATP以满足生命活动的需求。在此情况下,胞内NADH得到较多积累,TCA循环代谢流量减小,而转向糖酵解、乙醛酸循环等,并且这个过程伴随多种杂酸包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸等的产生,必将影响目的产物的产量。【结论】研究结果对于进一步采取措施优化溶氧的控制策略,提高目的产物的产量具有指导意义。     

一株家养野猪源猪圆环病毒2型的分离与鉴定

应用PCR方法从临诊疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)家养野猪病例的淋巴结和脾脏中扩增出预期长度的猪圆环病毒2型(PCV2)的DNA片段,在Dulac细胞中进行分离和培养,扩增全基因组序列后进行同源性分析.结果显示,扩增产物与家猪源参考毒株的序列同源性均在98%以上,该病毒与家猪源病毒差异不大.     

鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆与P基因的表达鉴定

将鹅源新城疫病毒的NP、P和L基因通过RT PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM-Teasy载体 ,再分别亚克隆到真核表达载体pCI neo上 ,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。利用P基因开放性阅读框 (ORF)上靠近终止密码上游的AgeI位点 ,将报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆进P基因真核表达重组质粒 ,分别转染COS-1细胞和CEF细胞 ,在倒置荧光显微镜下可见到绿色荧光 ,表明GFP基因已得到表达 ,由此证明P相似文献