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201.
表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建和鉴定 总被引:2,自引:0,他引:2
在克隆和鉴定新城疫病毒(NDV)F48E8株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175-1中启动子P7.5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175-1。将此质粒pFGHN1175-1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3~4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV—HN基因特异性探针进行斑点杂交试验以及用HN基因特异性引物作PCR检测,表明NDV—HN基因已插入鸡痘病毒基因组中。以NDV-HN蛋白特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,证实重组鸡痘病毒在感染细胞中表达了HN糖蛋白,从而成功建立了表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒。 相似文献
202.
【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白VP1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此VP1是研究亚单位疫苗的方向靶标。谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂。【目的】利用C. glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1的外源表达。【方法】根据VP1结构蛋白的基因序列、相应功能和C. glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1。C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1蛋白的表达情况。最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定本研究中生产的VP1的免疫活性。【结果】SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1蛋白能在C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36能提高蛋白产量。在此基础上,通过插入不同的5′UTR序列和VP1蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达。发酵试验表明,VP1摇瓶发酵培养最优条件为30 ℃、24 h。ELISA试验表明,本研究中的VP1可与阳性血清特异性结合。【结论】本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础。 相似文献
203.
在基础培养液 DME/F12(1:1)中加入10μg/ml 转铁蛋白(T),5μg/ml 胰岛.素(Ⅰ),10μmol/L 乙醇胺(E),10-9mol/L 亚硒酸钠(S)及1mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)等诸种添加剂成分而构成了本试验的无血清培养基,定名为 LDSF.试验表明,LDSF 可取代常规培养基 DMEM(含10—15%胎牛血清),用于骨髓瘤、杂交瘤细胞的长期传代培养,支持杂交瘤细胞稳定、持续地分泌特异单克隆抗体(McAb),并可用于细胞融合、冻存和复苏. 相似文献
204.
P物质对大鼠胃窦肌条收缩活动的影响及其机制探讨 总被引:2,自引:1,他引:1
本文利用器官浴槽孵育离体大鼠胃窦肌条,观察P物质(substanceP,SP)对肌条收缩的效应及多种拮抗剂或抑制剂对SP效应的影响。结果:(1)SP明显增强肌条收缩幅度,在剂量为8×10-11-8×10-7mol范围内里剂量-效应关系。SP4×10-8mol,使肌条收缩幅度增强160.9±23.0%.与生理盐水组比较P<0.001。(2)神经节阻断剂六烃季胺、5-HT2受体阻断剂赛庚啶、H1受体阻断剂苯海拉明、磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱使SP肌条收缩幅度增强效应明显减弱(P<0.05)。(3)阿托品、心得安、酚妥拉明、氟哌啶醇和纳洛酮预孵育后,SP增强收缩幅度的效应与单独SP组相比差异无显著性。结果提示SP可能是肠神经系统中的非胆碱能兴奋性递质,可能通过激活5-HT神经元、促使组织胺释放等途径而增强肌条的收缩幅度。 相似文献
205.
用MCA对K88粘附素扩原结构进行分析表明:在K88ab、K88ac和K88ad三种血清到中,同一种血清型的菌株至少能表达一个共同的型特异抗原决定簇;K 88ad菌林和K88ac菌株都能稳定地表达一个K88ab菌株不县有的共同的抗原决定簇;某些抗原决定簇仅存在于同一种K88血清型的部分菌株中。 相似文献
206.
207.
H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株的全基因克隆及序列分析 总被引:13,自引:2,他引:11
应用流感病毒通用引物[4]和H5N1亚型禽流感(Avian influenza virus, AIV)的型特异性引物,成功的扩增出H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株(简称A/D/SD/04)的全基因序列(包括5′和3′端的非编码区序列)。A/D/SD/04的基因组核苷酸全序列与18株网上公布的禽流感基因序列进行比较和分析,结果与4株鸭源H5N1的5~7个基因具99%以上的同源性;与14株H5N1有至少一个以上内部基因同源性在95%以上。与H9亚型AIV代表株A/Quail/Hongkong/G1/97(简称G1株)和A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)比较,除了非结构基因(Nonstructural gene, NS)与G1株的同源性为95.3%外,其余基因均在36.6%~92.1%之间。说明A/D/SD/04没有H9N2基因的直接整合,是H5N1毒株在自然界的重组株。推导的HA氨基酸序列分析,A/D/SD/04 的血凝素(Heamgglutinin,HA)裂解位点与比较的16株AIV的序列一致,是高致病性禽流感的分子特征(PQRERRRKKR/G),第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met)。神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失,但非结构蛋白(NS)没有在79~84氨基酸发生缺失。碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲禽类细胞的谷氨酸(Glu, E)。结合生物学特性和分子特征,A/D/SD/04对小鼠的致病力是由多种因素决定,其可能是一株对鸡高度致病,并逐渐获得对哺乳动物致病能力的中间重组病毒。 相似文献
208.
利用8质粒系统拯救A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒 总被引:6,自引:0,他引:6
应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS_1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。将A Chicken Shanghai F 98(CK SH F 98)株H9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polⅠ_polⅡ转录 表达载体pHW2 0 0 0中,构建成8个转录表达载体重组质粒。将这8个质粒共转染COS_1细胞,2 4h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,4 8h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒。经血凝、血凝抑制试验、序列分析和电镜观察,证实产生了CK SH F 98(H9N2 )株AIV。 相似文献
209.
水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析 总被引:12,自引:0,他引:12
采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。 相似文献
210.