3个植物源苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯的研究

[背景]乙酸肉桂酯是一种重要的香料化合物,在化妆品和食品工业上具有广泛的应用,传统的生产方法主要依靠植物提取和化学合成。[目的]通过筛选不同植物源的酰基转移酶,利用大肠杆菌从头合成乙酸肉桂酯。[方法]首先,通过在苯丙氨酸高产菌BPHE中表达异源基因苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase from Arabidopsis thaliana,AtPAL)、对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(Hydroxycinnamate:CoA Ligase from Petroselinum crispum,Pc4CL)和肉桂酰辅酶 A 还原酶(Cinnamyl-CoA Reductase from Arabidopsis thaliana,AtCCR),并结合大肠杆菌自身的内源性醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenases,ADHs)或醛酮还原酶(Aldo-Keto Reductases,AKRs)的催化作用构建了从苯丙氨酸到肉桂醇的生物合成途径。然后,苯甲醇苯甲酰转移酶(Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Nicotiana tabacum,ANN09798;Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Clarkia breweri,ANN09796)或苯甲醇乙酰转移酶(Benzyl Alcohol Acetyltransferase from Clarkia breweri,BEAT)被引入到上述重组大肠杆菌中发酵培养生产乙酸肉桂酯。最后,在大肠杆菌中过表达乙酰辅酶A合成酶(Acetyl Coenzyme A Synthetase,ACS)来提高底物乙酰辅酶A的量。[结果]探讨了 3个植物源苯甲醇酰基转移酶生物合成乙酸肉桂酯的能力,并应用于合成乙酸肉桂酯的细胞工厂,最终使乙酸肉桂酯最高产量达到166.9±6.6mg/L。[结论]植物源苯甲醇酰基转移酶具有一定的底物宽泛性,能以肉桂醇为底物催化合成乙酸肉桂酯。首次利用植物源的苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯,为微生物细胞工厂以葡萄糖作为碳源生产乙酸肉桂酯提供参考。     

枯草芽孢杆菌N2-10的基因组测序和比较基因组分析

【背景】枯草芽孢杆菌N2-10是一株具有较强抑菌能力且能产纤维素酶等多种水解酶的革兰氏阳性菌,在发酵饲料中具有较大的应用潜力。【目的】通过获得枯草芽孢杆菌N2-10的全基因组序列信息,进一步解析菌株次级代谢产物合成基因信息,并通过比较基因组学分析菌株N2-10与模式菌株的差异性,为阐明N2-10抑菌和益生机制提供理论基础。【方法】通过二代Illumina NovaSeq联合三代PacBio Sequel测序平台,对菌株N2-10进行全基因组测序,将测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释,并利用比较基因组学分析N2-10与其他菌株的差异。【结果】菌株N2-10基因组大小为4 036 899 bp,GC含量为43.88%;共编码4 163个编码基因,所有编码基因总长度为3594369bp,编码区总长度占基因组总长度的89.04%;含有85个tRNA、10个5S rRNA、10个16S rRNA、10个23S rRNA,以及2个CRISPR-Cas、1个前噬菌体和6个基因岛;在GO (gene ontolog)、COG (clusters of orthologous groups of...     

毕赤酵母液滴微流控高通量筛选方法的建立与应用

巴斯德毕赤酵母是当前应用最为方便和广泛的外源蛋白表达系统之一,为了进一步提高其表达外源蛋白的能力,文中建立了基于液滴微流控的毕赤酵母高通量筛选方法,并以木聚糖酶融合荧光蛋白为例,筛选获得木聚糖酶表达和分泌能力提高的突变株。通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒pPIC9K-xyn5-gfp,电转化至毕赤酵母GS115中得到表达木聚糖酶和绿色荧光蛋白的毕赤酵母SG菌株。该菌株经过常压室温等离子体诱变后进行单细胞液滴包埋,液滴培养24h后进行微流控筛选,获得高表达木聚糖酶的突变菌株,进而用于下一轮的诱变突变库构建和筛选。以此类推,经过5轮液滴微流控筛选,获得一株高产菌株SG-m5,其木聚糖酶活为149.17U/mg,较出发菌株提升300%,分泌外源蛋白的能力较出发菌株提高160%。文中建立的毕赤酵母单细胞液滴微流控高通量筛选方法能达到每小时10万菌株的筛选通量,筛选百万级别的菌株库仅需10h,消耗荧光试剂体积100μL,对比传统的微孔板筛选方法降低试剂成本近百万倍,为高效、低成本筛选获得表达和分泌外源蛋白能力提高的毕赤酵母提供了一条新途径。     

尼可霉素生物合成基因簇的改造及其异源表达

摘要:【目的】异源表达尼可霉素生物合成基因簇,为尼可霉素核苷和肽基缩合机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素的组合生物合成奠定基础。【方法】以含有尼可霉素生物合成基因簇的pNIK 为出发质粒,通过PCR-targeting 的方法,将基因簇中sanG和sanF的启动子替换为组成型hrdB启动子,构建重组质粒pNIKm。通过接合转移的方法分别将pNIK和pNIKm导入天蓝色链霉菌M1146中,获得异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm,并通过RT-PCR检测基因簇的表达情况。最后通过抗菌活性实验和产物的分离 鉴定,比较M1146-NIK和M1146-NIKm的抗菌活性和尼可霉素的产生情况。【结果】pNIK和pNIKm在异源宿主天蓝色链霉菌M1146成功表达; M1146-NIK和M1146-NIKm均有明显的抗菌活性; M1146-NIK和M1146-NIKm均能产生少量的尼可霉素X、Z和假尼可霉素Z;M1146-NIK大量积累尿苷,而M1146-NIKm大量积累尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型苏氨酸。【结论】尼可霉素生物合成基因簇成功异源表达,并分离鉴定了尼可霉素产物及其生物合成中间体。本研究将为尼可霉素核苷和肽基缩合的酶学机制研 究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素组合合成新型杂合抗生素提供理论依据和指导。     

内蒙古西部旱区机采棉膜下滴灌水氮耦合效应

为探明内蒙古西部旱区机采棉膜下滴灌水氮耦合对棉花生长发育、产量、品质,以及水分与氮素利用效率的影响,在内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗,设置3种灌溉定额(216、288、360 mm,分别记为W₁、W₂、W₃)和3种施氮水平(127.5、195、262.5 kg·hm^-2,分别记为N₁、N₂、N₃)的完全组合处理,进行了大田棉花膜下滴灌试验.结果表明: 水分是膜下滴灌棉花生长的决定因素,增加灌水量可以促进棉花株高增加,提高棉花各部分干物质积累量,但降低生殖器官与地上部干物质比例.W₃处理单株成铃数较W₁和W₂分别提高25.4%和17.5%,单铃质量分别降低5.8%和4.6%,籽棉产量分别增加18.1%和11.9%;单株成铃数提高是籽棉产量增加的主要因素.水氮调控对籽棉产量的互作效应显著,W₁与W₂灌水量下N₁处理籽棉产量最高;W₃灌水量下N₂处理较N₁、N₃籽棉产量分别增加8.5%和31.9%.水氮调控对纤维品质整体无显著影响.W₁N₁处理水分利用效率最高,为1.37 kg·m^-3,与W₃N₂处理差异不显著;W₃N₁处理氮肥偏生产力最高,为51.35 kg·kg^-1.在本试验条件下,灌水增产效应显著,施氮则在水分充足条件下对籽棉产量形成有促进作用.其中,灌水360 mm、施氮195 kg·hm^-2处理显著促进地上部干物质积累,籽棉产量最高,水分利用效率和氮肥偏生产力分别达1.30 kg·m^-3和36.41 kg·kg^-1,节水增产效果显著,是内蒙西部旱区较理想的机采棉水氮调控模式.     

扬子北缘钟祥地区奥陶系弗洛阶笔石动物群研究

湖北钟祥下奥陶统弗洛阶岩性以灰黑色页岩为主,夹粉砂岩及灰岩透镜体,化石丰度和分异度高。通过系统的化石采集和鉴定,于钟祥温峡口剖面识别出笔石7属31种,大体上为扬子地台区的常见属种。自下而上分为Didymograptellus bifidus带、Corymbograptus deflexus带和Azygograptus suecicus带。该序列与宜昌、南漳地区一致,但在笔石动物群组成面貌上差异较大,可能与钟祥地区在早奥陶世位于扬子台地边缘,富集的营养物质和低氧的环境更利于笔石动物群的繁盛和笔石化石的保存有关。     

药用丁基胶塞与注射用氨曲南相容性研究

目的:考察药用丁基胶塞与注射用氨曲南澄清度的相关性。因为胶塞中的挥发性成分易于迁移出瓶塞,在与药粉接触过程中会被药物表面所吸附,形成胶体或药粉团,进而影响澄清度。本文研究胶塞中的挥发性物质和抗氧化剂能否迁移至氨曲南粉末中,引起溶液浑浊,甚至超过中国药典规定的限度。方法:随机选取23家生产企业样品中的1批,分别对胶塞和粉末进行GC-MS分析,测定挥发物质。以Agilent HP-5 MS(30 m×0.25 mm,0.25μm)色谱柱;载气:高纯氦气;流速:1.0 m L/min;柱温:50℃,保持5 min,以5℃/min速度升温到200℃,保持6 min;进样量:1.0 m L。顶空条件:110℃恒温40 min;采用HPLC法对6家单位25批样品进行十一种抗氧化剂的检测。色谱柱:Ultimate XB-C18,4.6×250 mm(Agilent),10μm;测定波长:200 nm;流动相水-乙腈(7:3,按梯度洗脱);柱温:60℃;进样体积:20μL。结果:胶塞和粉末中均检测出四种环硅氧烷类挥发物质。25批样品中测出了四种抗氧剂1076、BHT、TP、TBHQ。在溶液的澄清度不合格的样品中BHT的含量较高,影响了药品的质量。结论:样品溶液的澄清度与粉末中环硅氧烷类化合物的检出量有一定的相关性。胶塞中的挥发性物质和抗氧化剂会迁移到注射用氨曲南溶液中从而影响到澄清度。建议企业提高胶塞生产工艺,提高药品的质量,保障用药的安全。     

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块，可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成，但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此，本研究通过酶的挖掘，选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接，采用Rosetta虚拟突变确定突变热点，结合薄层层析初筛和纯化后复筛，最终筛选到突变体L39A，其比酶活为13.45 U/mg，相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明，野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5，且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定；两者最适温度为55℃，但L39A热稳定性较野生型提高；突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明，在OD600=4...