连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。     

现代狩猎在野生动物管理中的作用

尽管现代狩猎有别于传统狩猎,但仍是一个备受争议的话题.国际上有大量学者从生态学、行为学、遗传学、经济学等角度研究狩猎对野生动物的影响.本文综合国内外文献,综述了狩猎在种群动态、行为、基因及表型方面可能对野生动物产生的影响.研究表明： 规范管理下的适当狩猎是管理野生动物种群的有效方式,有利于野外种群数量的恢复甚至增加.但过度或不当的狩猎会影响野生动物种群性比、出生率和死亡率,改变动物觅食行为及社群空间行为,对动物基因及表型产生人工选择.国际上很多国家已成功开展适当的狩猎活动,而我国要想在野生动物管理中科学应用狩猎,应基于生态学、经济学理论,参考国际上的成功案例,科学制定狩猎限额,加强狩猎监督管理,兼顾生态保护与经济发展.     

秀丽隐杆线虫在神经退行性疾病研究中的应用

神经退行性疾病(neurodegenerative diseases,NDs)是指由大脑和脊髓的神经元或其髓鞘的丧失所导致的疾病。发病人群主要为老年人,随着人口老龄化的加速,其发病率逐年递增,给中老年患者身心健康和生活质量带来严重影响,同时给家庭带来了沉重的负担。近几年对于神经退行性疾病的关注日益增加,为了寻找致病因子和有效的治疗药物,各种模式生物被人们应用,特别是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans),已经成为人们研究NDs的经典模式动物。该文主要阐述秀丽隐杆线虫在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等疾病研究中的应用,从疾病产生的原因、线虫作为模式动物研究NDs的优势、线虫疾病模型筛选潜在药物等方面进行论述。     

高比活人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

人睫状神经营养因子(hCNTF)及其突变体有望成为治疗肥胖症的新型药物。为了减少hCNTF的副反应,提高其疗效,在hCNTF四重突变体AX15 (R13K)的基础上引入S16 5D Q16 6H突变,构建了高比活的DH_AX15 (R13K)突变体。体外和体内实验表明DH_AX15 (R13K)的活性约是AX15 (R13K)的5倍。同时体内实验还发现DH_AX15(R13K)的作用比AX15 (R13K)更为持久。这种更为持久的作用可能是由于活性提高而非半衰期延长引起的。高比活的hCNTF突变体一方面可以在保证疗效的前提下减少蛋白用量,减少副反应;另一方面可以在不增加副反应的前提下增加最大耐受剂量,提高疗效,在临床应用上具有潜在的优势     

耳聋基因TMC同源基因的重大研究进展

正机械感受如触觉、听觉、本体感受等感觉信息对于调控生物体的行为具有至关重要的意义.近年来,越来越多的研究发现机械感受离子通道或蛋白对于维持机体正常生命活动极其重要.很多机械感受受体在体内分布广泛,在不同的组织中可发挥着不同的功能(如Nomp C与piezo)[1~8].在听觉传导中,跨膜离子通道样蛋     

灰盖鬼伞过氧化物酶功能表达及部分酶学特性

摘要:【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115 在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5 U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH 为5.0,在pH 4.5－6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS ＞ 愈创木酚＞ 2,6-二甲氧苯酚＞ 2,4-二氯苯酚＞ 苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。     

定向进化提高灰盖鬼伞过氧化物酶染织废水脱色效率

【目的】获得染织废水脱色能力增强的灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】使用基因合成及定点突变平台合成突变灰盖鬼伞过氧化物酶基因CIPmt4(I49S、V53A、M166F和M242I),并调整密码子至毕赤酵母偏好性。以CIPmt4为模板进行定向进化,经过三轮易错PCR和高通量筛选得到一个酶学性质显著改善的突变体(CIPmt5)。通过3D建模和分子动力学模拟分析蛋白的结构及热稳定性,并进一步研究CIPmt5和野生型CIP对刚果红、氨基黑、甲基橙、次甲基蓝、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝共7种染料的脱色能力。【结果】序列分析显示该突变体积累了I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F共5个氨基酸突变,与野生型灰盖鬼伞过氧化物酶相比,以ABTS为底物酶活性是野生型的2.01倍(24.44 U/mg),最适反应p H由5.0提高到6.5,最适反应温度由25°C提高到45°C。除次甲基蓝外对其它染料脱色的最适p H都往中、碱性方向偏移,脱色率普遍高于野生型。模型分析显示CIPmt5活性中心更开放,热稳定性增强。【结论】突变体酶CIPmt5能够更好地替代野生型灰盖鬼伞过氧化物酶应用于染织业染料脱色、化工废水和染织废水的生物修复。     

典型喀斯特小流域不同植被类型间土壤养分的差异性及其空间预测方法

植被类型制约着土壤结构和元素的异质化过程,致使土壤养分空间分布存在差异性.本文研究了典型喀斯特小流域不同植被类型间土壤养分(全氮TN、全磷TP、全钾TK、有机质SOM)含量分布的差异性,分析比较了普通克里金、回归模型、基于植被类型的回归模型对土壤养分预测的精度.结果表明: TN、TK、SOM与植被类型显著相关(P<0.05),TP与植被类型无显著相关(P=0.390),且TN和SOM在灌木林与耕地之间的差异性显著,TK在乔木林与灌草丛、灌木林与耕地、灌草丛与耕地间的含量差异皆显著;非连续的典型喀斯特小流域地形因子空间异质性较高,基于各样点间真实地形因子的多元线性回归预测模型精度优于基于已知点和预测点位置信息的普通克里金预测方法,且基于植被类型的回归预测模型提高了TN的预测精度.     

高密度建成区湖滨建筑空间形态对湖泊热缓释效应的影响情景模拟

城市湖泊对于缓解调节城市热岛效应具有重要意义,目前湖滨建筑空间形态对城市湖泊的降温潜力影响作用仍不明晰。以长沙市梅溪湖及周边区域为研究对象,采用实测与CFD (Computational Fluid Dynamics)数值模拟相结合的方式验证了湖泊的热缓释效应规律,重点探讨了建筑后退湖岸距离、环湖建筑围合程度、临湖建筑高度对高密度建成区湖泊热缓释效应的影响。结果表明:(1)研究所用CFD计算模型对再现高密度建成区湖泊缓释效应的强度和影响范围具有较强的拟合优度,可以有效地作为湖泊水体降温潜力的评价工具,梅溪湖对其下风向550 m范围内的热缓释作用显著。(2)优化湖滨建筑空间形态对于湖泊下风向区域的热缓释作用影响最为明显,最大降温幅度达1.86℃,对湖泊下风向的最大缓释距离可达622 m范围内。(3)不同湖滨建筑空间形态下的湖泊热缓释效能存在差异,其中降低建筑高度和缩小环湖建筑围合程度对湖泊热缓释的积极影响强于增大建筑后退湖岸距离。结论能够加深对城市湖泊水体热缓释效应的认识,有助于规划设计者从整体热环境感知的角度规划建设城市湖滨空间,使得城市湖泊水体的生态效益得到最大优化。     

微生物学课程创新实践教学模式探索

为激发本科生对微生物学的学习兴趣、训练实验技能、拓展创新思维、促进素质教育,我们探索了"课堂讲授—实验课程—课题研究"三位一体、"理论—技能—创新实践"同步训练的微生物学教学模式,首次将研究生引入本科生素质教育中,并在教学方法、手段、考核等方面进行了改革试验,实践证明这一教学模式对主动掌握理论知识、激发创新精神、提高学生素质都有积极的推动作用。