神经酰胺转运蛋白在非囊泡转运中的作用机制

神经酰胺转运蛋白（ceramide transfer protein,CERT）是介导神经酰胺（ceramide）非囊泡转运的载体.它包括3个功能区域： PH、FFAT和START.PH和FFAT分别发挥高尔基体和内质网的靶向作用,羧基端的START主要用于与神经酰胺结合.CERT的转运受多种因素的调节,依赖于PKD和PP2Cε诱导的丝氨酸重复区域（SR）的磷酸化和去磷酸化,氧化应激刺激的CERT三聚体形成,以及PI4KⅢβ催化的高尔基体接头PI4P的生成等.CERT功能障碍会导致细胞易受氧化应激的损害.本文拟从CERT的结构、作用及其调节机制3方面进行综述,揭示CERT的研究进展.     

微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用的鉴定

为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GST pull-down结合质 谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western 印迹杂交证实了质谱的结果．构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白．利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用,激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合．肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用．hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用,为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证．     

一种与抗生素调控基因afsk高度同源的新基因——Spy1的克隆

普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素 类抗生素.目前国外对普那霉素的基因工程研究甚少,国内尚属空白,这阻碍了利用基因工程 的方法来提高普那霉素产量的发展.本文通过对普那霉素产生菌——始旋链霉菌柯斯基因组 文库的构建和菌落原位杂交,筛选出了与普那霉素高产密切相关的新基因所在的柯斯质粒,并通过 酶切分析和Southern杂交确定了该基因所在的酶切片段,对酶切片段进行亚克隆测序,获得了 与天蓝色链霉菌中抗生素调控基因afsk同源新基因的全长克隆,该新基因包含有1个2 127 bp的开放阅读框(ORF),编码708个氨基酸的蛋白,命名为Spy1.对该新基因的生物信息学初步分析表明,该基因编码的是丝/苏氨酸蛋白激酶.     

HIV-1整合酶四聚体结构模拟及其活性位点分析

HIV-1复制需要HIV-1整合酶将其环状DNA整合进宿主DNA中,这其中包括2个重要反应,即“3′-加工”和“链转移”,两者均由HIV-1整合酶催化完成.阻断其中的任一反应,都能达到抑制HIV-1复制的目的.因此,了解HIV-1整合酶的完整结构和聚合状态,对深入探讨其作用机理及设计新型抑制剂具有重要的指导作用.然而,迄今为止仅有HIV-1整合酶单独结构域的晶体结构可供参考,而其全酶晶体结构尚未获得解析.本研究利用分子模拟技术,通过蛋白质 蛋白质/DNA分子对接、动力学模拟等方法,构建了全长整合酶四聚体的结构模型、HIV-1 DNA与整合酶复合物的结构模型,进一步从理论上证实HIV-1整合酶是以四聚体形态发挥催化作用,明确“3′-加工”和“链转移”在HIV-1整合酶上的催化位点.同时,通过与作用机理相似的细菌转座子Tn5转座酶等的结构比对,推测HIV-1整合酶的核心结构域中应有第2个Mg^２＋存在,其位置螯合于Asp64与Glu152之间.在HIV-1整合酶结构研究的基础上,有望进一步设计出新的抗艾滋病药物.     

水稻悬浮细胞再生及根癌农杆菌介导转化的影响因素

已经成功报道的农杆菌介导的水稻遗传转化多以活力较高的胚性愈伤为材料,很少以水稻悬浮细胞作为受体．另外,利用农杆菌转化多数都是通过浸泡的方式进行侵染．本实验利用滴加浸染法进行农杆菌介导转化水稻悬浮细胞,探讨影响 DNA 转化效率的因素．研究显示,在转化前,将水稻悬浮细胞在愈伤诱导培养基上培养1～2周,诱导产生直径为2～3 mm的微小愈伤组织对转化非常重要.微小愈伤组织大小不应小于 2 mm;对悬浮细胞短时间培养不但会缩短植株再生时间,而且会提高转化效率．此外,侵染农杆菌的浓度、侵染时间和不同侵染方法也影响 T-DNA 插入基因组的效率．用 1 ml Ａ600值为 0.5 浓度的农杆菌悬液滴加在水稻悬浮细胞诱导的愈伤,培养3 d或直到可见农杆菌菌落,此方法可以得到较高转化效率．将再生的潮霉素抗性的转化植株在含有 50 mg/L 潮霉素的分化和生根培养基中筛选得到,并对转化植株 gus 基因的表达进行 PCR 检测.结果显示,用 Ａ600值为 0.5 浓度的农杆菌浸泡侵染 20 min和滴加浸染法,分别得到PCR阳性植株率为 70% 和92%.     

核定位信号及其分析策略

真核细胞核膜上的核孔复合体 (nuclear pore complex, NPC) 是细胞核内外进行物质交换的主要通道, 分子量较小的化合物可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核, 而分子量为50 kD以上的蛋白质则只能通过主动转运进入细胞核. 以这种方式进入细胞核的 蛋白质必须在其氨基酸序列上拥有特殊的核定位信号(nuclear localization signal, NLS)以被相应的核转运蛋白(karyopherins) 识别. 核定位信号具有多样性, 包括经典核定位信号(classical NLS,cNLS), 内输蛋白β2识别的核定位信号（又称PY模体-NLS）和其它类型的NLS. 每一类NLS具有相似的特征, 但并不具有完全保守的氨基酸组成. 不同的NLS, 往往对应着各不相同的核输入机制. 而对同一蛋白质来说, 也可能同时拥有几个功能性的NLS. 研究核定位信号一方面可以帮助揭示新的大分子物质核转运机制, 另一方面也有助于发现一些蛋白质的新功能. 本文对常见NLS的分类进行了总结, 并介绍了两种常用的NLS预测软件及鉴定NLS的一般策略.     

.用酵母双杂交系统筛选CENP-E相互作用蛋白

纺锤体检验点(spindle checkpoint)是一个重要的细胞分裂生化调节通路, 可监督染色体正确分离和传代．着丝粒相关蛋白E (centromere-associated protein E, CENP-E)是一个分子量为312 kD的微管马达驱动蛋白,可以衔接纺锤体微管与动点并参与纺锤体检验点调控．为研究CENP-E的作用机理,以其动点结合区域为诱饵蛋白,用酵母双杂交技术从人HeLa细胞 cDNA 文库中筛选出了Nuf2蛋白．体外的pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验表明, Nuf2蛋白通过其卷曲螺旋(coiled-coil) 功能域特异结合CENP-E的 C 末端区域,间接免疫荧光显示Nuf2与CENP-E共定位于细胞有丝分裂期染色体的动点．由此推论, CENP-E 通过Nuf2的直接作用参与构筑动点-微管界面,进而参与细胞有丝分裂纺锤体检验点信号转导通路,为染色体正确分离发挥调控作用．     

食源性肥胖大鼠下丘脑差异表达蛋白的蛋白质组学分析

建立食源性肥胖大鼠模型,对正常大鼠和肥胖大鼠下丘脑全蛋白进行双向凝胶电泳,产生下丘脑蛋白双向凝胶电泳图谱.对图谱进行比对分析后,从凝胶上切取差异表达的蛋白点,经胶内酶解,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 对酶解后的肽段进行分析,再经数据库（NCBInr）检索,对蛋白质进行鉴定.研究发现,正常组表达图谱可检测到1　160±15（n=5）个蛋白点,肥胖组表达图谱可检测到1　070±10 （n=5）个蛋白点,与对照组相比,匹配率大于80％.并且成功鉴定了17种差异表达蛋白质,其中有7 种在肥胖组表达上调,10种表达下调.它们分别属于代谢酶、细胞周期调控因子、抗氧化蛋白、信号传导蛋白、蛋白酶体相关蛋白、细胞骨架蛋白以及未知蛋白等. 与正常对照组相比,肥胖组的蛋白质表达存在着较大差异,通过对差异表达蛋白的分析,提示了在肥胖发生的过程中,下丘脑神经中枢经历了一个非常复杂的信号活动和特定改变,为深入认识肥胖的发病机制奠定了基础.     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

园艺植物细胞的超微结构研究

细胞是生物体最基本的结构和功能单位。综述了园艺植物的器官生长发育过程中细胞的超微结构研究,果实发育过程中的组织及细胞超微结构研究,逆境下不同器官细胞超微结构变化的研究。指出了当前研究中的不足及今后的发展方向。